1986年,Sen和Baltimore首先发现,在B细胞核提取物中有一种能与免疫球蛋白κ的轻链编码基因的增强子κB序列(GGGACTTTCC)特异结合的核蛋白因子,称之为NF—κB(Nuclear factor—kappa B,NF-κB)。研究发现,NF-κB调节的靶基因编码蛋白至少包括细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、粘附分子、免疫受体、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等。通过调节靶基因表达产物,NF-κB信号通路参与了感染、炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤等病理过程以及细胞周期调控与细胞分化等。　　 核因子κB抑制蛋白(Inhibitor of NF-κB,IκB)是核因子κB的抑制因子。NFKBIA(Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor,alpha)为IκBα的官方基因名。作为NF—κB抑制物,IκBα对NF-κB的激活失活有着重要的调节作用。　　 在生理状态下,非活化状态的NF-κB与IκBα以聚合的三聚体形式或与前体蛋白聚合的二聚体形式存在于胞浆中。此时由于NF-κB的核定位序列(Nuclearlocalization signal.NLS)被遮盖,因而不能转位入核调控基因的转录翻译,处于无活性状态。当细胞受到合适的胞外信号如LPS(lipopolysaccharide,LPS)、TNF-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、某些变应原等多种因素的刺激时,引起一系列连锁的酶促反应。首先IκBα被磷酸化,随后又被泛素化,泛素化的IκBα由于空间构象发生变化,被ATP依赖性26S的蛋白酶体识别并降解。当IκBα被蛋白酶体降解后,NF-κB就被释放出来,在其核定位序列(NLS)介导下转位到细胞核内,与靶基因上的κB位点发生特异性结合,调控相关基因的转录。　　 让人们感兴趣的是,IκBα基因启动子也存在κB序列,因此NF-κB可调控IκBα基因的表达。新生成的IκBα与NF-κB结合,从而抑制NF-κB的活性并使其聚集在细胞浆中。由此可以看出IκBα的细胞内水平对NF-κB信号通路的激活、失活具有重要作用。但过往对IκBα表达调控的研究主要集中在转录水平与翻译后水平,而对其转录后调控的机制涉及不多。　　 在真核细胞内,转录和翻译过程发生于不同的部位,使得遗传信息从DNA流向蛋白质的过程中,可以在多点实现基因表达的调控,以调节细胞内的蛋白表达水平。已有的研究表明:基因转录后调控主要包括mRNA在细胞中的定位、稳定性及其翻译效率,相关的调控元件多位于转录本的非翻译区(untranslatedregions,UTR),包括5’UTR和3’UTR.,其中尤以3’UTR更为重要。因此,深入研究mRNA3UTR调控基因表达机制的将有助于我们更好的揭示机体生命活动的奥秘。　　 大量的研究表明:一类被称之为RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)的调节因子在基因的转录后调控起着非常重要的作用。RNA结合蛋白是一类在生物进化过程中高度保守并在生物体内广泛存在的蛋白,它通过其RNA结合结构域特异性地与靶RNA的特定结构或序列结合,参与了pre-mRNA的剪切、编辑、运输、稳定性和降解、翻译等基因转录后调控过程。因此,鉴定出与mRNA、特别是其3’UTR结合的RNA结合蛋白,对于阐释该基因表达的转录后调控,蛋白水平的变化等过程有着重要的意义。　　 综上所述,我们认为通过对NFKBIA mRNA3’UTR功能的初步研究和与其相互作用的RNA结合蛋白的鉴定,有助于揭示NFKBIA基因表达的转录后调控机制,促进我们对NF-κB信号通路调控机制的进一步了解。　　 在本研究中我们首先采用双荧光素酶报告基因系统(Dual-LuciferaseReporter Assay System,DLRAS)研究了NFKBIA3’UTR的功能。在DLRAS检测中,我们将NFKBIA的3’UTR序列克隆到pGL3载体中荧光素酶(luciferase)报告基因的下游(pLuNB),同时使用海肾(Renilla reniformis)荧光素酶作为内参,以消除不同转染组之间因转染效率和细胞生存环境不同带来的实验误差。经双荧光素酶活性检测发现NFKBIA mRNA3UTR能显著下调其上游的荧光素酶报告基因的表达,提示其含有负调控基因表达的顺式调控元件。　　 在上述实验的基础上,我们进一步采用Biotin RNA-pull down技术鉴定了与NFKBIA3UTR相互作用的RNA结合蛋白。我们首先通过体外转录的方法合成了生物素标记的NFKBIA3’UTR的RNA探针,将其与RAW264.7细胞的裂解液共孵育,然后再采用链霉亲和素偶联的琼脂糖纯化与生物素标记的探针相互作用的RNA结合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分离后进行银染,将获得的蛋白条带切下进行质谱(mass spectrometry)鉴定。　　 经质谱鉴定和数据库搜索,我们得到23个蛋白质,包括Myosin9、SFPQ(Splicing factor,proline-and glutamine—rich)、HnRNP Q(Heterogeneous nuclearribonucleoprotein Q)、MYL12B(Myosin regulatory light chain12B)、HSC70(Heat shock cognate71 KDa)、EF1A1(Elongation factor1-alpha1)、GRP78(glucose-regulated protein78 KDa)、Nucleolin、EIF2S3(Eukaryotic translationinitiation factor2 subunit3)、ACTB(Actin,cytoplasmic2)、Nucleolar RNA helicase、RPS6(40S ribosomal protein S6)、RPS4X(Ribosomal protein S4,Ⅹ-linked)、RPL13(60S ribosomal protein L13)、RPS8(40S ribosomal protein S8)、RPS9(40Sribosomal protein S9)、RPL24(60S ribosomal protein S24)、RPS24(40S ribosomalprotein S24)、RPS11(40S ribosomal protein S11)、RPS13(40S ribosomal proteinS13)、RPS18(40S ribosomal protein S18),RPS16(40S ribosomal protein S16)、RPS15a(40S ribosomal protein S15A)等。我们相信这些蛋白的发现为揭示NFKBIA3UTR的功能以及进一步解读NF-κB/IκBα信号通路的调控机制提供了新的线索以及潜在的调控分子。根据查找文献和数据搜索发现HnRNP Q可作为一个剪切体组件在pre-mRNA剪切过程中扮演重要角色,同时也可调控某些基因如c-fos mRNA的稳定性。鉴于HnRNP Q特殊的蛋白结构及其在众多基因转录后调控方面的重要性,我们选取HnRNP Q作为下一步研究的候选蛋白。　　 最后,我们对HnRNP Q与NFKBIA3’UTR之间的相互结合及其生物学功能作了进一步的研究。结果显示,HnRNP Q与NFKBIA3’UTR之间存在相互作用,而共表达HnRNP Q显著上调pLuNB载体荧光素酶基因的表达(p<0.01)。这些结果表明,HnRNP Q与NFKBIA3’UTR确实存在着相互作用,并且HnRNP Q能促进其基因的表达。同时,我们采用HnRNP Q的特异性siRNA抑制RAW264.7细胞内HnRNP Q的表达,发现跟对照组相比,干扰组NFKBIA的mRNA水平显著降低,提示HnRNP Q在细胞中可通过与NFKBIA3’UTR的相互结合而参与了对NFKBIA基因的转录后调控。　　 总之,我们通过双荧光素酶报告基因检测系统发现NFKBIA3’UTR中存在负调控基因表达的调控元件,并进一步通过Biotin RNA-pull down技术结合MALDITOF/TOF质谱鉴定了与NFKBIA3’UTR相互结合的蛋白质,且对其中的HnRNPQ蛋白进行了初步的分析。本研究取得如下结果:　　 1.成功构建pLuNB荧光素酶报告基因表达载体,并采用双荧光素酶报告基因检测系统研究发现NFKBIA3’UTR对基因的表达起负调控作用。　　 2.利用Biotin RNA-pull down方法得到与NFKBIA3’UTR相互作用的蛋白复合物。　　 3.经SDS-PAGE凝胶电泳分离获得的蛋白复合物,并经质谱鉴定得到与NFKBIA3’UTR相互作用的23个候选蛋白质分子。　　 4.于23个候选蛋白中选取跟mRNA调控密切相关的HnRNP Q RNA结合蛋白进行了功能验证,发现HnRNP Q与NFKBIA3UTR确实存在相互作用,并能促进基因的表达。　　 5.采用特异性siRNA干扰HnRNP Q表达后,NFKBIA的mRNA水平跟对照组相比有显著性的降低。　　 6.NFKBIA3’UTR功能的研究和RNA结合蛋白HnRNP Q的鉴定与功能的研究对于进一步研究NFKBIA基因转录后调控的分子机制和NF-κB/IκBα信号通路的调控具有重要的意义,为更深入的了解通过NF-κB信号通路引起的炎症、应激、变态反应和肿瘤生成等机体异常反应有重要的促进作用。