1.目的本研究以具有“扶正消积”作用的抗肺癌验方芪玉三龙汤为依托,以PD-1信号通路为研究靶点,观察芪玉三龙汤对Th1免疫反应的影响,阐述芪玉三龙汤通过PD-1信号通路增强Th1免疫反应抑制肺癌的分子机制。本研究同时应用中医整体思维,从机体内源性代谢物水平探讨芪玉三龙汤在肺癌治疗中的作用及其干预机制,从而为从现代生物学角度优化芪玉三龙汤提供科学依据。2.方法2.1芪玉三龙汤对A549细胞增殖和凋亡的影响应用MTT法评价芪玉三龙汤处理前后A549细胞活力情况,筛选出芪玉三龙汤50%的抑制浓度（IC50）,DAPI法观察价芪玉三龙汤处理前后A549细胞凋亡情况和形态学变化。2.2芪玉三龙汤对肺癌荷瘤小鼠瘤体重量和体积的影响采用LLC细胞培养皮下移植法建立肺癌小鼠皮下移植瘤模型,48只模型小鼠随机分为4组:模型组（Model）,芪玉三龙汤低剂量组（L-QYSLD）:每日20g/kg（相当于临床等效量的1倍）中药药液灌胃,芪玉三龙汤中剂量组（M-QYSLD）每日:40g/kg（相当于临床等效量的2倍）中药药液灌胃和芪玉三龙汤高剂量组（H-QYSLD）:每日80g/kg（相当于临床等效量的4倍）中药药液灌胃,其余12只健康正常小鼠作为对照组。模型组和对照组每天均给予0.9%生理盐水0.1m L/10g灌胃。连续给药10天,每日观察小鼠一般情况,每3天监测一次瘤体的生长情况。用游标卡尺测量瘤体的垂直直径以评价芪玉三龙汤对LLC小鼠的治疗作用,并选取最佳剂量作为芪玉三龙汤治疗组做进一步体内实验及代谢组学研究。2.3芪玉三龙汤通过PD-1信号途径增强Th1免疫反应抑制肺癌的研究采用LLC细胞培养皮下移植法建立肺癌小鼠皮下移植瘤模型,72只模型小鼠随机分为4组:对照组（Control）:每日按照0.1m L/10g生理盐水灌胃,化疗组（DDP）:第1、3、5天腹腔注射DDP溶液0.2ml,中药组（QYSLD）:每日40g/kg中药药液灌胃,联合组（DDP+QYSLD）:每日按照40g/kg的剂量灌胃中药药液灌胃,同时于1、3、5天腹腔注射DDP溶液0.2ml。连续治疗21d,每日观察小鼠一般情况,于治疗后7、14和21天处死6只小鼠,取脾脏分离脾淋巴细胞,应用ELISA法和流氏细胞技术检测不同时间点小鼠CD8+T细胞的杀肿瘤细胞效应和CD4+T细胞免疫反应情况、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数目变化情况,分析T细胞中PD-1阳性细胞的比例及记忆性T细胞中凋亡细胞比例。对于治疗21天的小鼠,处死结束后完整取出肺脏,在解剖显微镜下计数肺表面转移瘤结节。2.4芪玉三龙汤对肺癌荷瘤小鼠血浆代谢物的影响实验研究二中模型组、对照组、芪玉三龙汤中剂量组小鼠在处死前经眶内返流区采集血标本,采用基于UPL-CQTOF/MS的非靶向代谢组学方法,对肺癌荷瘤小鼠的功能代谢产物进行鉴定和相对量化,并对芪玉三龙汤的干预效果进行了研究。最后,采用MVDA评估LLC小鼠血浆代谢物水平的变化,筛选出与芪玉三龙汤治疗相关的潜在生物标志物。3.结果3.1芪玉三龙汤对A549细胞增殖和凋亡的影响MTT染色还原实验显示,芪玉三龙汤以浓度相关性的方式抑制A549细胞的生长。芪玉三龙汤的50%抑制浓度在24h估计为18.19±0.51mg/ml。DAPI染色后,荧光显微镜观察结果表明,芪玉三龙汤以浓度相关性的方式诱导A549细胞凋亡,芪玉三龙汤有效诱导A549细胞形态学改变,包括核分裂和核固缩。3.2芪玉三龙汤对肺癌荷瘤小鼠瘤体重量和体积的影响芪玉三龙汤可有效降低肺癌荷瘤小鼠瘤体的重量和体积。经芪玉三龙汤处理10天的肺癌荷瘤小鼠的瘤体的重量和体积明显低于生理盐水组处理的小鼠。M-QYSLD组小鼠的肉瘤体积和重量明显低于L-QYSLD组,且差异有显着性（P<0.01）,与H-QYSLD组相当。3.3芪玉三龙汤通过PD-1信号途径增强Th1免疫反应抑制肺癌的研究中药组小鼠T细胞增殖能力最强、IFN-γ和TNF-α的分泌水平最高,联合组次之,其它组T细胞增殖能力较低（P<0.01）。联合组小鼠中随着治疗时间的延长CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数目显著减少,中药组和化疗组CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数目也减少,但没有芪玉三龙汤组和联合组明显。中药组和联合组小鼠CD8+T细胞特异性杀肿瘤细胞效应显著高于其它组（P<0.05）,在中药组和联合组小鼠脾脏T细胞中PD-1阳性细胞的比例显著低于其它组（P<0.001）,同时其CD44highCD4+T细胞的凋亡比例也显著低于其它组（P<0.001）,治疗21d后处死小鼠完整取出肺脏,发现联合组小鼠肺转移瘤结节最少,效果明显优于化疗组（P<0.001）,中药组相比于模型组也有明显的治疗效果（P<0.001）。3.4芪玉三龙汤对肺癌荷瘤小鼠血浆代谢物的影响经MVDA统计分析,PCA评分图显示,M-QYSLD组与Model组相比,呈回归趋势,显示芪玉三龙汤具有干预与肺癌相关的代谢紊乱的能力。在此基础上,共筛选出21种与肺癌发病并与芪玉三龙汤干预作用相关的潜在生物标志物。潜在的生物标志物主要涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、类固醇激素生物合成、脂肪酸降解和花生四烯酸代谢。4.结论4.1芪玉三龙汤以浓度相关性的方式抑制A549细胞的生长并诱导细胞凋亡。4.2芪玉三龙汤有效降低肺癌荷瘤小鼠瘤体的重量和体积。4.3芪玉三龙汤可通过下调PD-1信号途径促进Th1免疫反应增强,抑制记忆性T细胞凋亡,提高小鼠CD8+T细胞的杀肿瘤细胞效应和CD4+T细胞免疫反应,改善小鼠细胞免疫力,从而达到抑制肺癌的作用。4.4芪玉三龙汤干预肺癌的机制主要涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、类固醇激素生物合成、脂肪酸降解和花生四烯酸代谢,其中花生四烯酸、鞘脂代谢途径与免疫抑制、细胞毒性T细胞和Th1介导的抗肿瘤免疫的显著有关。代谢途径分析表明:LCAT,PI合成酶,磷脂酰转移酶和PS脱羧酶的活性上调,胆碱激酶,PC合成酶,CL合成酶,ASM,s PLA2和c PLA~2α活性的下调参与了芪玉三龙汤的干预作用。