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壳聚糖是天然多糖类高分子甲壳素的脱乙酰产物,具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性,有利于其作为骨修复材料,并应用于骨组织工程,作为种子细胞或活性生长因子的生物载体材料.随着壳聚糖衍生改性的研究发展,壳聚糖类复合材料在骨填充修复材料、骨组织工程和软骨组织工程等方面显现了广阔应用前景.本论文仿照骨和甲壳的天然构成与矿化机制,进行新型仿生复合材料微结构的构筑与设计,开展了壳聚糖接枝谷氨酸及天冬氨酸材料、磷酸钙盐/壳聚糖-聚氨基酸仿生复合支架的研究,为壳聚糖组织工程材料研究提供了新思路.
研究工作分为四个阶段,主要研究内容和研究成果如下:
一、半脱乙酰度壳聚糖原料的制备研究.
采用醋酸水溶液体系,由91﹪脱乙酰度壳聚糖与乙酸酐反应,制得52﹪脱乙酰度壳聚糖产物.研究发现,乙酸酐与壳聚糖原料用量比、醋酸浓度等反应条件影响着乙酰化反应程度,可用于控制制备不同脱乙酰度壳聚糖产物.IR、CP/MAS-<13>CNMR表征了半脱乙酰度壳聚糖结构.采用XRD与热分析研究了壳聚糖粉末样品的晶型结构和聚集态特性.结果表明,与高脱乙酰度壳聚糖原料相比,半脱乙酰度壳聚糖产物的晶体结构发生改变,结晶度降低,并表现出较强的水结合能力和较低的热稳定性,对此通过分子间氢键差异的分析进行了解释.采用IR、xRD、溶胀实验和力学测试比较研究了不同脱乙酰度壳聚糖膜的结构、结晶性能、溶胀溶解性能和力学性能.结果表明,壳聚糖膜的溶胀率随着脱乙酰度的减少而增加,尤其是半脱乙酰度壳聚糖膜呈水速溶性.壳聚糖膜的拉伸强度和断裂伸长率与脱乙酰度有关,而半脱乙酰度壳聚糖膜的断裂伸长率明显改善.XRD测试表明,半脱乙酰度壳聚糖膜结晶度高,分析认为其具有层状结晶结构,从而引起各性能的改变.
二、引入谷氨酸的壳聚糖材料仿生矿化性能的探索实验分别制备了戊二醛交联壳聚糖膜、戊二醛交联谷氨酸/壳聚糖膜材料,进行仿生矿化研究.IR、ESCA测试表明,利用戊二醛交联将谷氨酸引入壳聚糖膜结构.采用SEM、EDAX、XRD、ICP研究了磷酸钙盐在膜材料表面沉积生长的情况.研究发现,在模拟体液(15×SBF)浸泡初期,先形成Ca/P比为1.36～1.37细小颗粒状磷酸钙盐沉积,随后在底层上成核生长Ca/P比为 10.46～1.49 片状堆积磷酸钙盐沉积,且在浸泡过程中,两层沉积的密度逐渐增加.SEM测试表明,戊二醛交联程度影响壳聚糖膜上沉积磷酸钙盐的形貌与数量,壳聚糖与戊二醛摩尔比为25:1的膜仿生矿化性能较20:1和15:1强.与戊二醛交联壳聚糖膜相比,壳聚糖/氨酸膜材料表面沉积磷酸钙盐的密集程度增加,表明谷氨酸的引入对促进壳聚糖材料体外矿化的作用较明显.三、壳聚糖接枝氨基酸系列制备技术的研究分别在水的均相条件、乙酸乙酯溶剂的异相条件下,以壳聚糖的氨基引发N.羧酸酐(NCA)开环聚合,制备了接枝L.谷氨酸甲酯壳聚糖产物.均相接枝反应中,以52﹪脱乙酰度壳聚糖为原料,在中性条件下反应转化率可达41.0﹪.异相接枝反应中,增加NCA的用量和适当延长反应时间,可提高谷氨酸甲酯接枝侧链聚合度.采用IR、CP/MAS-<13>CNMR.对均相接枝物、异相接枝物的结构进行表征.结果表明,谷氨酸甲酯侧链通过酰胺键与壳聚糖结合,形成梳状接枝产物.XRD谱图中,在20=8.3°处出现衍射峰,是接入谷氨酸甲酯侧链引起的.DSC、TG/DTG测试发现,均相接枝物、异相接枝物高温一侧吸放热峰的数量与位置,较原料有明显改变,并互有不同,反映了各壳聚糖接枝产物由于结构和接枝量的差异,具有不同的热稳定性.接枝物在1mol·l<-1>氢氧化钠水溶液中水解反应,使壳聚糖上谷氨酸甲酯接枝侧链碱解生成谷氨酸.新接枝方法可用于壳聚糖材料的表面改性,赋予材料特殊性质以满足不同要求.
以磷酸为催化剂,热缩聚合成摩尔比分别为10:0、8:2、5:5的天冬氨酸.谷氨酸共聚物,在DMF体系中,与壳聚糖进行异相接枝反应.合成摩尔比为2:8的天冬氨酸-谷氨酸共聚物可溶于水,与壳聚糖进行均相接枝反应.IR、CP/MAS-<13>CNMR测试表明,壳聚糖氨基使共聚物中酰亚胺环开环反应,制得的接枝产物结构明确.XRD谱图中,在2θ=15.1°处出现新衍射峰,是由共聚物接枝链引起.DSC热分析结果可见,对比接枝摩尔比分别为10:0、8:2、5:5共聚物的壳聚糖产物,其热稳定性,随着接枝链中羧基比例的增加而增强,且比壳聚糖原料略有提高.接枝物在2mol·l<-1>氢氧化钠水溶液中进行水解反应,使未反应的酰亚胺环水解开环.新的合成方法为壳聚糖材料的进一步开发利用提供了可能.四、壳聚糖系列支架材料的制备与性能研究采用冷冻干燥法制备天冬氨酸一谷氨酸共聚物交联壳聚糖支架材料,分别进行了IR、XRD、SEM、孔隙率测定、力学性能测定,考察了组分和交联改性对其结构形貌的影响.研究发现,壳聚糖支架材料交联后,孔隙率较原多孔支架略有减小,但仍保持较高孔隙率,范围为85﹪～95﹪.交联后支架材料孔隙大小可控制在直径为40～200μm,支架材料多孔结构及孔隙间相互通透性未明显改变.交联后壳聚糖支架材料压缩性能改善.体外细胞培养研究表明,成骨细胞在支架中粘附性和生长状态良好.从四氮唑盐(MTT)测试结果看,壳聚糖支架的细胞粘附增殖量高于交联支架材料.其中,5wt﹪-8:2交联支架细胞培养结果略好于其它交联支架材料.壳聚糖及其交联支架材料经明胶处理后,成骨细胞粘附增殖量增加.含丁二酰亚胺结构的天冬氨酸一谷氨酸共聚物作交联剂,为更有利地利用壳聚糖材料作为组织工程支架提供了新方法.
分别制备了壳聚糖.聚氨基酸支架材料、磷酸钙盐/壳聚糖.聚氨基酸仿生复合支架,进行IR、XRD、SEM、孔隙率测定、力学性能测定,研究了材料结构与表面形貌、孔隙率、孔形态等性能.研究发现,壳聚糖系列多孔支架均形成超过90﹪的高孔隙率.扫描电镜照片观察到多孔支架内孔径分布较宽,孔相连性好,壳聚糖.聚氨基酸支架孔径尺寸为50～250μm,磷酸钙盐/壳聚糖.聚氨基酸仿生复合支架孔径尺寸为100～300μm,且仿生复合支架中磷酸钙盐呈亚微米级密实颗粒状结合.测试表明,支架样品的压缩强度均在10-10<2>kPa数量级.体外细胞培养研究表明,成骨细胞在支架材料表面粘附和增殖生长状态良好,呈组织化趋向.MTT测试表明,壳聚糖一聚氨基酸支架、磷酸钙盐/壳聚糖.聚氨基酸复合支架的细胞培养结果较好,部分样品优于羟基磷灰石/壳聚糖复合支架样品CHTT/HAP-80/20.系列支架经明胶处理后细胞粘附增殖量明显增加,表明由明胶引入细胞结合域有促进作用,并与复合的磷酸钙盐呈现协同效应.磷酸钙盐/壳聚糖.聚氨基酸仿生复合支架有望成为培养成骨细胞的组织工程材料.