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目的:
趋化因子CXCL12α及其受体共同参与了多种慢性肝脏疾病的发病过程,本研究通过检测CXCL12α在原发性肝细胞癌(HCC)患者肝脏组织中的表达水平,以及CXCL12α转录子3’非翻译区(3’UTR)“GA”插入性基因突变(GA+)在不同慢性肝脏疾病患者中的基因频率,结合患者的临床病理进行分析,探讨趋化因子CXCL12α转录子表达在HCC发病中的作用机制,以及CXCL12α转录子3’UTR不同基因型在对CXCL12α表达的影响,进一步阐述CXCL12α与HCC发病的关系。
方法:
所有样本收自2010年9月至2011年4月间首都医科大学附属北京佑安医院的住院患者。其中有72例确诊的HCC患者的全血样本,76例慢乙肝患者(CHB)的全血样本,25例HBV感染后自发免疫清除的(spontaneousimmuneclearanceafterHBVinfection,SICI)的健康人(HBsAb+,HBcAb+)全血标本。全血标本用于提取全血中的单个核细胞(PBMC),再提取PBMC中的DNA,运用错义匹配PCR的方法,对患者的CXCL12α转录子3’UTR中GA(+)基因进行检测。参考文献中提出3’UTR在健康人群中的突变频率,分析实验各组中患者基因突变频率的差异。
肝癌组织与癌周组织标本来源于同期因HCC行外科肝切除术的患者,共收集72例HCC患者的肝癌组织及癌旁组织。组织样本先于-80℃保存。提取组织中的RNA,将其逆转录为cDNA,运用实时荧光定量PCR的方法,检测组织中CXCL12α的含量。分析HCC患者中肝癌及癌旁组织、肝癌不同分化程度,以及3’UTR不同基因型中的CXCL12α的表达。
构建含CXCL12α转录子3’UTRGA(+)突变与野生型的质粒,即CXCL12α-3’UTR(WT)和CXCL12α-3’UTR(MU),与pRL-CMV共转染无CXCL12α表达的细胞系Hep2。检测不同转染细胞中的荧光指数。分析CXCL12α3’UTR及突变对CXCL12α表达的影响。
实验结果采用WindowsSPSS13.0进行统计学分析。
结果:
对CXCL12α转录子3’UTR中GA(+)突变的检测表明,在72例HCC患者中,有杂合子26例,野生型纯合子44例,突变型纯合子2例。76例临床诊断为CHB患者中,共检测出杂合子21例,野生型纯合子53例,突变型纯合子2例。在25例SICI的健康人中,共检测出杂合子17例,野生型纯合子7例,突变型纯合子1例。HBV感染后SICI组与HCC组、CHB组、正常组中CXCL12α转录子3’非翻译区(3’UTR)的突变基因频率差异均有统计学意义(P=0.016、0.001、0.000,)。在HCC组、CHB组、正常组之间的突变基因频率差异均无统计学意义。各组间基因纯合子的基因频率差异无统计学意义。
利用构建的质粒标准品绘制出CXCL12α、CXCL12β以及β-actin的标准曲线。RT-PCR检测表明在HCC患者的肝癌组织中,CXCL12α、CXCL12β的含量较癌旁组织中低。经统计学分析,CXCL12α的含量在HCC组织与癌旁组织中的差异有统计学意义(P=0.000)。比较72例HCC患者CXCL12α转录子3,UTR不同基因型中CXCL12α表达,可见在不同基因型组中,CXCL12α的表达含量差异无统计学意义(P=0.148)。结合61例资料完整的HCC患者的病理分型进行分析,其中包括高分化类型10例,中分化类型39例,低分化类型13例。其中,CXCL12α在低分化类型中的含量最高,与中、高分化组含量差异有统计学意义(P=0.004、0.013)。但中分化组与高分化组间CXCL12α含量差异无统计学意义(P=0.727)。
将重组质粒pGL3-promoter-3’UTR与pRL-CMV载体共转染至Hep2细胞中,经过荧光检测,计算其荧光指数,重组质粒pGl3-promoter-3’UTR-MU转染的细胞中,荧光活性与质粒pGL3-promoter-3’UTR-WT荧光指数差异无统计学意义(P=0.297),但其都明显低于低于质粒空白对照组(P=0.000)。
结论:
1、肝癌组织中CXCL12α及CXCL12β的含量均低于癌旁组织,这与肿瘤的发生与转移的规律相符;考虑到HCC癌旁组织病理表现为慢性肝炎或肝硬化,提示CXCL12α在肝脏的慢性炎症反应过程中发挥一定的作用;
2、在肝癌以及癌旁组织中,CXCL12α的表达水平均高于CXCL12β,说明在肝脏组织中,CXCL12α是优势转录子;
3、对HCC患者不同病理分型组的CXCL12α含量进行分析,CXCL12α在低分化组中的含量最高,说明CXCL12α高表达与肿瘤的恶性程度与转移相关;
4、研究显示SDF-1-3’GA(+)突变在25例SICI的健康人中频率达到38.0%,其可能参与HBV自发性免疫清除的过程,提示在乙肝病毒的感染过程中,SDF-1-3’GA(+)突变对机体起到保护性作用;
5、在HCC患者中,CXCL12α转录子3’UTR不同基因型的CXCL12α的含量无明显差异。转染实验发现CXCL12α3’UTR能够下调质粒pGL-3-promoter中荧光蛋白的表达,突变型与野生型对于基因的表达下调作用无明显差异。提示CXCL12α转录子3’UTR为基因表达的调控区域,其功能有待于进一步研究。