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目的:细丝蛋白A(filaminA,FLNa)属于非肌性肌动蛋白结合蛋白,是一种主要分布在细胞质的大分子蛋白质,起初被认为能够绑束纤维状肌动蛋白,并可以诱使其形成强有力的立体肌动蛋白凝胶而形成细胞骨架。有研究表明,细丝蛋白A在结直肠癌细胞中的表达呈低水平而在正常细胞组织的表达则呈高水平。FLNa表达水平与TNM分期,肝脏转移,淋巴结转移,肿瘤的浸润深度具有相关性,但与患者的年龄,性别,病变部位,肿瘤大小,肿瘤分化程度,大体类型以及病理类型不具有相关性。本研究旨在将FLNa的基因克隆到载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,在脂质体作用下转染人结肠癌细胞SW480,观察其对裸鼠体内成瘤的影响。
方法:
首先将本实验所需要的相关试剂进行配制,然后进行细胞培养。将FLNa的基因质粒载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa,以脂质体介导方式转染这些SW480细胞,在本实验中,我们首先确定了G418的筛选浓度。用以确定的G418浓度筛对三组细胞进行选后,获得了FLNa基因稳定表达的SW480/FLNa细胞。使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)两种发方法证实了FLNa在肿瘤细胞中得到了较好的表达与转染。同时,我们获得了稳定表达FLNa基因的的SW480/FLNa细胞。用MTT法检测上述三组SW480细胞的体外增殖能力,并且以培养时间为横轴(X轴),吸光度值为纵轴(Y轴),绘制细胞生长曲线。先将30只裸鼠随机分为3组。然后将SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480三组细胞分别接种于3组裸鼠的皮下,并对瘤体生长情况进行观察;在8周之后引颈处死全部裸鼠,完整剥离瘤体、称重,并且对肿瘤重量进行分析并计算抑瘤率;将肿瘤组织经过固定、脱水透明、浸蜡包埋以及脱蜡处理制成切片,然后经过HE染色,在镜下观察肿瘤组织的形态学变化。最后,应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析以及处理。并且资料采用t检验、单因素方差分析、Dunnett-t检验进行相关检验。设检验水平α=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。
结果:
1：通过使用RT-PCR方法检测三组SW480细胞结果显示:SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞的mRNA表达水平分别为1.27±0.11、0.12±0.02和0.14±0.03。SW480/FLNa组比较SW480组高(P=0.019＜0.05),SW480/pcDNA3.1组与SW480组间差异无统计学意义(P=0.865＞0.05);而使用Western blot方法检测结果显示,SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞的蛋白表达水平分别为0.78±0.03、0.01±0.00和0.01±0.00。SW480/FLNa组较SW480组高(P=0.008),SW480/pcDNA3.1组与SW480组间差异无统计学意义(P=0.943)。所以,可以看出FLNa基因在SW480细胞即(SW480/FLNa组)中获得较为稳定的表达。
2：经过MTT实验检测结果表明,三组细胞在每24h的吸光度值差异无统计学意义,细胞生长曲线基本重叠,所以,三组细胞的体外增殖能力相似。
3：通过实验表明SW480/FLNa组较SW480/pcDNA3.1和SW480组的瘤体生长速度慢,且SW480/FLNa组瘤体的重量低于SW480组,实验统计学数据显示:[(0.67±0.06)g vs(5.90±0.77)g,P=0.000];其抑瘤率为88.7±3.5％(P=0.000);
4：经过镜下观察发现,SW480/FLNa组瘤体组织出现退变坏死。
结论:
1：转染FLNa基因的人结肠腺癌SW480细胞在裸鼠体内的生长较未转染该基因的另外两组SW480细胞缓慢。
2：经过HE染色,在光镜下显示,SW480/pcDNA3.1和SW480组裸鼠肿瘤组织呈巢状排列,瘤细胞异型明显,核染色质深,可见较多的分裂相;而SW480/FLNa组肿瘤组织退变坏死严重。
综上所述,FLNa基因具有抑制SW480细胞在裸鼠体内生长的作用,提示FLNa基因具有抑制肿瘤形成的作用。进一步研究其抑制肿瘤的机制,可以为肿瘤的治疗提供新的思路。