CYP2E1为代谢药物及毒物的关键酶，在不同水平上研究外源物对该酶的活性及表达在水产药理学和水域环境毒理学中具有重要意义。本论文的研究内容分为四章：第一章是P450酶综述及研究进展；第二章是鱼类P450酶体外研究体系的筛选；第三章诱导剂和抑制剂对草鱼CYP2E1活性影响的研究；第四章是诱导剂和抑制剂对草鱼CYP2E1表达调控作用的研究。主要内容分别如下： 1.草鱼原代肝细胞作为P450酶体外研究模型的评价 以消化法制备草鱼原代肝细胞，观察细胞产量与活力，通过测定培养液中的生化指标以及形态学变化观察其在制备中的受损及恢复程度，同时研究了诱导剂乙醇对肝细胞的影响。结果表明细胞24h贴壁，但培养5～9d后，细胞停止生长，出现老化迹象，胞质中出现空泡。第5d后细胞中LDH和ALB的分泌量表明细胞开始处于修复迹象，但细胞同时表现出老化状态。原代细胞对乙醇的耐受能力较弱，乙醇浓度10～40mM时，LDH的渗出量与乙醇浓度呈正相关，乙醇浓度为80～160mM时，细胞发生严重的死亡脱落。细胞暴露于10mM的乙醇0～24h，LDH渗出量均呈上升趋势，表明10mM乙醇依然会对原代肝细胞造成一定的损伤。由以上数据表明草鱼原代肝细胞并非为P450酶体外研究的最佳模型。 2.鱼类细胞系P450酶的基本指标 检测P450酶代谢是药物生物转化的主要途径，P450和b5含量的多少可以作为其药物代谢能力高低的一个衡量标志。本研究中以差速离心法提取组织或细胞的微粒体，利用Lowry法测定细胞的总蛋白与微粒体蛋白含量，以CO还原差示光谱法测定P450和b5的含量。发现对照组WRL-68 P450和b5的含量远高于鱼类细胞，草鱼三种细胞中P450和b5含量由高到低依次为L8824>CIK>CO。试验同时测定了草鱼肝组织中P450和b5的含量，L8824的P450含量约为肝组织含量的0.35倍，表明体外培养细胞保留了体内相应组织一定含量的P450，证实了P450酶的潜在活性，并表明体外细胞可作为P450酶的反应体系。本章试验结果对细胞中微粒体蛋白含量的测定同时可用于后续P450酶活的研究，L8824可作为体外研究反应体系的首选，CIK和CO可用于对不同组织酶活的分析比较等研究。 3.鱼类细胞中CYP2E1活性检测方法学研究 建立了HPLC法测定L8824中CYP2E1的活性，以CZX为底物，Ant为内标，二氯甲烷提取样品中药物，45℃吹干，流动相溶解，正己烷去脂，HPLC法测定药物浓度，CYP2E1的活性以每mg蛋白单位时间内HCZX的生成量表示。经测得该方法样品CZX平均回收率大于81.56％，各样品同内变异系数小于5.99％，日间变异系数小于4.73％；HCZX平均回收率均大于84.84％，各样品日内变异系数小于4.09％，日间变异系数小于3.58％；CZX和HCZX在细胞中的LOD为0.01μg．mL-1，LOQ为0.05μg．mL-1。结果表明该方法简便、准确，适用于CYP2E1酶活的检测。在此基础上对CZX在L18824中的代谢进行了研究，经测得CZX的药时曲线方程为Ct/Co=-0.161Ln(t)+0.7981，酶促反应动力学方程为1/V=813.21×1/[S]+40.548，方程参数Vmax为0.025μg．min-1.mg-1，Km为20.055μg．mL-1，表明CZX在L8824中的代谢缓慢，CYP2E1基础酶活不高。该结果为深入研究鱼类CYP2E1酶活奠定基础。 4.L8824中CYP2E1体外诱导模型的建立及酶活抑制研究 通过细胞的可诱导性研究证明L8824适合用于体外诱导细胞模型的建立，研究了乙醇和EF对CYP2E1的作用，并建立了CYP2E1的体外诱导模型，考虑了EF在细胞中的消除值，准确建立了EFX对CYP2E1抑制作用的剂量效应关系。经过对CYP2E1诱导条件的优化及筛选，采用Log-Normal模型拟合，得到最佳诱导模型下，孵育时间为1h，诱导时间为24h，其EC100为3.7145μg．mL-1，P100为0.3728μg．min-1.mg-1。采用Logistic模型对EF所形成“S”形剂量效应曲线进行拟合，参数EC50与P100表明延长EF作用时间及增加作用浓度对CYP2E1酶活的降低起关键作用。对照组、乙醇及EF组的消除半衰期分别为18.23h、13.33h和26.35h。酶促反应动力学参数表明乙醇诱导的CYP2E1与底物的亲和力较高，酶促反应强度较大。试验中同时建立了EF脱乙基酶在肝细胞中的基础酶活模型，借助其消除半衰期推出达到50％抑制效应时EF的实际浓度CO=173.26EC50/(173.26-t)。该公式的建立在P450酶活影响的研究中首次考虑了外源物的消除值，准确的计算出酶活与作用物之间的剂量效应关系。本研究准确、省时、高效的在体外研究了CYP2E1的可诱导、抑制特点。 5.探针药物法评价诱导剂和抑制剂对草鱼体内CYP2E1活性的影响 研究中以CZX为底物的探针药物法评价了诱导剂乙醇和抑制剂EF对草鱼体内CYP2E1活性的影响，以验证体外结果及推测体内外CYP2E1研究的相关性，为临床合理用药提供参考。将草鱼随机分为对照组、乙醇组和EF组。通过优化选择乙醇以3.8mg．kg-1.bw连续3次，EF以20mg．kg-1.bw连续4次为研究的作用次数。以20mg．kg-1.bw给予CZX，在一系列的时间点内取血、肝脏和肾脏，通过药物定量发现乙醇对CYP2E1有诱导作用，EF表现抑制作用，与体外作用结果相符。乙醇组t1/2β是对照组的0.4倍，而EF组t1/2β是对照组的5.6倍。乙醇组血浆中CYP2E1探针药物的CL约为对照组2倍，EF组为对照组1/3倍。另外一个评价指标AUC为EF组>对照组>乙醇组。结果表明CYP2E1代谢的药物与对其酶活有诱导作用的乙醇等药物合用时，为保证其有效作用，应适当加大前者的用量以达到更好的治疗效果；CYP2E1代谢的药物与其其抑制类药物合用时，为防止药物中毒情况的发生，应适当减少前者的用量。同时针对肝脏和肾脏疾病的治疗，对用药方案做出了具体的调整。另外，采用体内外研究所得到的相关数据对体内外代谢药物的研究模型进行了比较及推测，建立了体内外FDCL之间的比例关系，并预测了试验中所研究的外源物与CYP2E1探针药物相互作用的风险程度。本研究结果对新渔药开发、水产养殖中指导临床合理用药以及减少药物残留具有极为重要的意义。 6.诱导剂和抑制剂对L8824中CYP2E1表达调控作用的研究 以L8824为研究体系，分别选取乙醇和EF作为诱导剂和抑制剂，在分子水平上研究两者对CYP2E1基因表达的调控作用。经乙醇或EF作用24h或72h的细胞，运用RT-PCR技术检测细胞内mRNA表达量变化，从而分析乙醇和EF对CYP2E1mRNA表达的影响。同时经以上两种药物处理的细胞用Western blot技术分析CYP2E1蛋白表达的变化情况。结果表明乙醇和EF在一定剂量和一定作用时间状态下对L8824中CYP2E1的在mRNA和蛋白表达都有调控作用。乙醇促使L8824中CYP2E1的mRNA转录水平上升，并进一步引起蛋白翻译的增加。EF是通过抑制CYP2E1转录降低了mRNA水平，继而抑制蛋白翻译，导致CYP2E1蛋白含量下降。结合CYP2E1酶活的测定，在酶活、mRNA和蛋白水平上建立了一套完整的研究鱼类CYP2E1与药物相互影响的研究体系。