论文部分内容阅读
Bcl-2家族蛋白是细胞内源凋亡通路的主要调控因子,包括具有促凋亡和抗凋亡功能的两类蛋白质。其中抗凋亡蛋白成员主要包括Bcl-2, Bcl-XL和Mcl-1,它们已经被确认为抗肿瘤靶标,正在进行小分子BH3功能模拟研究。BH3功能模拟分子通过占据抗凋亡蛋白的BH3结合沟槽,释放促凋亡蛋白Bax/Bak,或者释放BH3-only蛋白激活Bax/Bak,诱导肿瘤细胞凋亡,是一类已经进入临床实验阶段的高效、高特异性的抗癌药。近期研究发现,磷酸化的Bcl-2蛋白(pBcl-2)也是一个重要的抗肿瘤靶标。许多类型的肿瘤细胞中Bcl-2蛋白被高度磷酸化修饰,并且Bcl-2磷酸化水平与多种BH3功能模拟分子的抗性相关。例如,在多种白血病细胞系中,pBcl-2 (Ser70)抵抗ABT-737和Obatoclax的杀伤作用。但是,目前还没有发现可以直接靶向pBcl-2的小分子抑制剂,尤其是至今没有关于pBcl-2的BH3沟槽的结构研究,这也限制了pBcl-2小分子抑制剂的分子设计。本研究基于广泛的BH3功能模拟分子的分子药理机制、结构生物学等研究结论,提出如下假设：Bcl-2的磷酸化修饰别构调节了BH3沟槽的结构,导致其或者增强了对促凋亡蛋白的亲和力,或者在结构上阻断了现有BH3功能模拟分子的结合而引起药物抗性。因此,本研究设计了基于细胞表型的pBcl-2抑制剂的筛选,在本课题组研发的BH3功能模拟分子S1的衍生物中,筛选可能被pBcl-2的BH3沟槽兼容的小分子,并研究其分子药理机制,明确Bcl-2磷酸化修饰对其抗凋亡功能的调节机制。本文首先利用稳定转染方法获得分别表达非磷酸化Bcl-2 (npBcl-2)模拟蛋白(HA-AAA-Bcl-2; T69A/S70A/S87A)和pBcl-2模拟蛋白(HA-EEE-Bcl-2; T69E/S70E/S87E)的HL-60早幼粒白血病细胞,对23个S1衍生物进行筛选。结合Bax-/-Bak-/-小鼠胚胎成纤维细胞毒性实验的交叉筛选,得到了特异性依赖Bcl-2通路、拮抗pBcl-2功能的化合物S1-16。接下来,通过ITC和ELIAS技术分别检测了S1-16,S1和ABT-737对EEE-Bcl-2蛋白的亲和力,以及与Bid-BH3肽段竞争结合EEE-Bcl-2 BH3结合沟槽的能力。结果表明S1-16能够竞争Bid-BH3肽段结合EEE-Bcl-2的BH3沟槽,而ABT-737和S1则不能。此外,通过定点突变技术进一步证实了S1-16对EEE-Bcl-2蛋白的亲和力来自于BH3结合沟槽。本论文通过免疫共沉淀实验分别检测了S1-16, S1, ABT-737对HL-60 (EEE-Bcl-2),OCI-AML3细胞内Bcl-2家族蛋白相互作用的影响,并用免疫印迹法检测了Bax/Bak的激活、细胞色素C释放、PARP的剪切。这一系列的实验结果表明S1-16是通过解离细胞中pBcl-2/Bax和pBcl-2/Bak二聚体,诱导Bax/Bak依赖的内源凋亡来杀死肿瘤细胞的。化合物S1-16是唯一一个能够在过量表达EEE-Bcl-2和内源Bcl-2高度磷酸化的肿瘤细胞系中诱导凋亡的BH3功能模拟分子。本研究筛选得到了首个pBcl-2直接抑制剂——S1-16。利用Sl-16,首次证实Bcl-2在loop区的磷酸化导致BH3沟槽的变构效应,提出了pBcl-2 BH3的沟槽与npBcl-2BH3沟槽在结构上的差异,为pBcl-2小分子抑制剂的设计及优化提供分子结构基础。同时,S1-16作为更广谱的BH3功能模拟分子,不仅为肿瘤的治疗提供了新的策略,也为研究Bcl-2蛋白磷酸化的意义提供了直接的分子工具。