纳米二氧化硅（silicon dioxide,SiO₂）俗称白炭黑,因特殊的理化性.质被广泛应用于食品、涂料、橡胶、化妆品和医药卫生等许多领域,享有“工业味精”之美誉。中国是世界白炭黑生产大国之一,随着纳米SiO₂应用的日益广泛,相关行业人群接触的机会越来越多,其潜在危害不容忽视。动物实验研究表明,纳米SiO₂经呼吸道进入体内后可引起大/小鼠肺部炎症反应和肺组织纤维化等。纳米Si02致肺纤维化作用的机制目前尚未完全明了。上皮间充质转化（epithelial-to-messenchymal,EMT）是肺纤维化进程中的重要环节。已有研究报道miRNAs的异常表达与EMT的发生过程有关,Let-7d、miR-192、miR-124、miR-26a、miR-10b、miR-487a等可能通过TGF-β1信号通路在EMT的发生发展过程中发挥重要的调控作用。TGF-β1可以通过依赖Smads的方式诱导EMT,刺激肺上皮细胞转化为肺间质细胞,促进肺纤维化的发生。本研究在前期纳米Si02经一次性气管灌注大鼠染尘60、90天时主要表现为肺间质纤维化的基础上,以高通量测序显示miR-702-3p为纳米SiO₂致大鼠肺组织纤维化中差异表达上调的miRNA为前提,经生物功能学分析发现,miR-702-3p 可能与转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）通路相关。miR-702-3p 可能通过预测靶基因骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）调控TGF-β1信号通路发挥调节EMT的作用从而参与纳米SiO₂致肺纤维化的发生发展过程。为阐明miR-702-3p在纳米SiO₂致大鼠肺组织纤维化中的生物调节作用及明确miR-702-3p、TGF-β1信号通路、EMT三者之间的关系,研究从整体动物和细胞两个水平来探讨相关分子机制,实验结果如下:1.在线数据库TargetScan预测miR-702-3p的靶基因,其可能靶基因共136个。GO和KEGG通路分析这些靶基因的生物功能学,发现miR-702-3p对TGF-β信号通路和Smad蛋白信号转导中有调控作用,本研究将TGF-β超家族成员之一的BMP-7作为miR-702-3p重要的预测靶基因,探索miR-702-3p参与调控纳米SiO₂诱导EMT的相关机制。2.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测结果显示,25mg/mL纳米Si02染尘60d后大鼠肺组织中miR-702-3p 表达是对照组的 2.04 倍（P<0.05）;BMP-7、TGF-β1、Smad3、E 钙粘蛋白（E-cadherin,E-cad）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle acti,α-SMA）、Ⅲ型胶原蛋白（Collagen type Ⅲ,COL3）mRNA 的表达分别为对照组的0.40、1.28、1.71、0.57、2.70、1.53倍,差异均有统计学意义（P<0.05）;蛋白免疫印迹法（Western Blot）检查结果表明,纳米SiO₂染尘组大鼠肺组织中BMP-7、TGF-β1、Smad3、E-cad、α-SMA、COL3蛋白表达量是对照组的0.60、1.48、1.24、0.65、1.43、1.23倍,差异均有统计学意义（P<0.05）。双荧光素酶报告基因检测结果显示,将野生型BMP-7的3’UTR的荧光素酶报告质粒载体分别与miR-702-3p mimic/NC 共转染于人肺腺癌上皮细胞系（A549 细胞）,miR-702-3p mimic 组与 miR-702-3p NC组的报告荧光值分别为0.73±0.010、1.00±0.005,差异有统计学意义（P<0.05）;将BMP-7突变位点的载体质粒再分别与miR-702-3p mimic/NC共转染于A549细胞,miR-702-3p mimic组与miR-702-3p NC组的报告荧光值分别为0.98±0.060、1.00±0.016,差异无统计学意义（P>0.05）。结果提示纳米SiO₂致大鼠肺间质纤维化过程中发生了 EMT,miR-702-3p与BMP-7可通过CCACCCG-GGUGGGC的位点结合,靶向抑制BMP-7的表达并激活TGF-β1信号通路,促进肺上皮细胞转化为肺间质细胞,产生胶原蛋白增加,发生肺纤维化。3.纳米SiO₂对大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383细胞）染尘24h,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测得其IC₅₀为 0.761 mg/mL,95%可信区间为 0.001～3.844 mg/mL。50μg/mL 纳米 Si02 染毒 NR8383 细胞 24h 后细胞的存活率在85%以上,酶联免疫吸附（ELISA）法检测纳米SiO₂染毒NR8383细胞24h上清液中TGF-β1含量为1612.67±15.32pg/mL,与阴性对照组1072.67±60.10pg/mL比较,差异有统计学意义（P<0.05）;纳米SiO₂染毒组NR8383细胞中miR-702-3p的表达水平是对照组的3.11倍（P<0.05）,BMP-7 mRNA与蛋白表达水平分别是对照组的0.39和0.30倍（P<0.05）。50μg/mL纳米Si02染毒NR8383细胞24h后的上清液与A549细胞共培养24h后,空白对照组、染毒NR8383细胞上清液组A549细胞的增殖率分别为（100±6）%、（101±5）%,差异无统计学意义（P>0.05）;染毒组A549细胞中miR-702-3p的表达是对照组的 1.22 倍（P<0.05）;BMP-7、TGF-β1、Smad3、E-cad、α-SMA、COL3 mRNA 表达水平分别是对照组的 0.25、1.33、1.53、0.99、6.75、2.68 倍,差异有统计学意义（P<0.05,E-cad 的 P>0.05）。纳米 Si02染毒组A549细胞中BMP-7、TGF-β1、Smad3、E-cad、α-SMA、COL3蛋白表达水平分别是对照组的0.48、1.88、2.20、0.40、1.91、3.1 倍,差异有统计学意义（P<0.05）。miR-702-3p mimic/mimic NC、miR-702-3p inhibitor/inhibitor NC 和空白对照组分别转染 NR8383 细胞48h 后,各组增殖率分别为（101.40±3.45）%、（100.03±2.91）%、（100.76±0.96）%、（92.37±3.26）%、（100±3.89）%,差异无统计学意义（P>0.05）,镜下未观察到细胞有明显变化;转染48h后miR-702-3p mimic转染组的miR-702-3p的表达水平是阴性对照组的27.78倍（差异倍数≥2,P<0.05）,表明miR-702-3p mimic转染成功;miR-702-3p inhibitor转染NR8383细胞48h后miR-702-3p的表达水平是阴性对照组的0.19倍（P<0.05）,miR-702-3p mimic转染组NR8383细胞中BMP-7mRNA与蛋白的表达水平分别是阴性对照组的1.07、0.43 倍（P<0.05）,miR-702-3p inhibitor转染组NR8383 细胞中BMP-7mRNA与蛋白的表达水平分别是阴性对照组的2.02、1.32倍（P<0.05）;miR-702-3pmimic转染组NR8383细胞中TGF-β1mRNA与蛋白的表达水平分别是阴性对照组的1.23、1.58倍（P<0.05）,miR-702-3p inhibitor转染组NR8383细胞中TGF-β1 mRNA与蛋白的表达水平分别是阴性对照组的0.52、0.63倍（P<0.05）,提示转染miR-702-3p可通过抑制BMP-7的表达,促进TGF-β1生成增加。TGF-β1、TGF-β1+TGF-β1受体阻断剂分别诱导A549细胞48h后,对照组、TGF-β1+RB组与TGF-β1组的细胞增殖率分别为（100±5.04%）、（106.28±1.38）%、（108.99±6.51）%,差异无统计学意义（P>0.05）;5ng/mL的TGF-β1诱导A549细胞48h后,观察到细胞从上皮样逐渐转变为成纤维细胞样,qRT-PCR检测结果显示,TGF-β1 诱导组 A549 细胞中 miR-702-3p、BMP-7、Smad3、E-cad、α-SMA、COL3mRNA 的表达水平分别是对照组的1.37、0.39、0.57、0.18、3.14、2.64倍（P<0.05）,TGF-β1诱导组A549细胞中BMP-7、Smad3、E-cad、α-SMA、COL3 蛋白的表达量分别是对照组的 0.41、1.82、0.72、1.61、14.51 倍（P<0.05）;TGF-β1受体阻断剂诱导3h后再给与TGF-β1诱导48h后A549细胞的形态未发生明显改变,BMP-7蛋白表达增加（1.68倍）外miR-702-3p、Smad3、E-cad、α-SMA、COL3mRNA与蛋白表达水平均未出现明显变化（P>0.05）。提示TGF-β1对miR-702-3p有上调作用,促使EMT的发生。综上所述,纳米SiO₂致大鼠肺间质纤维化过程中发生了 EMT,BMP-7是miR-702-3p的靶基因。miR-702-3p、TGF-β1信号通路与EMT过程密切相关,一方面miR-702-3p与BMP-7可通过CCACCCG-GGUGGGC的位点结合,抑制靶基因BMP-7的表达,活化TGF-β1信号通路,促使肺上皮细胞向肺间质细胞转化,胶原蛋白分泌增多,促进肺纤维化;另一方面TGF-β1可上调miR-702-3p的表达,促进EMT过程。