糖尿病肾病是导致肾衰竭常见的原因之一，糖尿病肾病早期特征为间歇性微量白蛋白尿，逐渐进展为持续性微量白蛋白尿、显性白蛋白尿，伴随尿白蛋白/肌酐比值增加，最终导致肾衰竭。在糖尿病肾病的早期阶段，严格控制血糖及血压可预防或延缓糖尿病肾病的进展。在临床治疗中，控制代谢异常和血流动力学异常是治疗的主要方式，除此之外缺乏特异性的治疗药物。　　甘地胶囊是上海市科委立项的医药科技攻关项目，由上海交通大学医学院附属新华医院药剂科创建，由黄芪、山茱萸、地黄、益母草、余甘子、槐花、黄芩、僵蚕八种中草药组成。经过上海市著名专家多次反复论证，临床验证显示甘地胶囊可用于治疗糖尿病血管病变，尤其是在微血管病变（糖尿病肾病、糖尿病眼底病变等）有良好的治疗作用。　　但甘地胶囊指标成分繁多复杂，目前针对该药的成分及作用机制尚无系统深入的研究。到目前为止，甘地胶囊主要成分不明，口服后吸收入血的成分尚无报导，治疗糖尿病肾病的分子机制亦不甚清楚。　　为探讨甘地胶囊治疗糖尿病肾病的物质基础及分子机制，进行了包括甘地胶囊治疗糖尿病肾病的临床疗效观察、甘地胶囊体内外化学物质学基础研究、临床代谢组学研究、多成分多靶点协同作用机制研究等四部分研究。　　一、甘地胶囊治疗糖尿病肾病的临床评价研究　　本研究采用单盲、随机、对照的研究方法。试验过程中，患者随机进入联用组（联用甘地胶囊+其他降糖药）及对照组（单纯西药降糖药物治疗），分别给予甘地胶囊和对照药物（安慰剂），每次3粒，每日3次，2个月为一疗程，观察3个疗程；以24小时尿白蛋白定量作为主要观察指标，同时观察血糖水平、肝肾功能、血脂、尿常规等指标。从2012年10月至2014年9月间，共纳入糖尿病肾病受试者63例，其中2例因生病住院退出，1例因发生腹泻中断，其中60例完成临床研究，并获得完整数据。　　本部分结果显示：1.联用组明显优于单纯西药降糖药物治疗的对照组。临床观察显示，年龄＞60岁、病程长、并发症多、对西药降糖治疗疗效差的难治糖尿病患者，联合甘地胶囊与其他降糖药物治疗后，血糖、血脂、血流变等多项指标，都出现改善趋势。2.甘地胶囊可以显著降低患者的24小时尿微量白蛋白量，延缓糖尿病肾病的进展，保护和改善肾脏功能，从而提高患者的生命质量，且患者在服用甘地胶囊2个疗程(4个月)后24小时尿微量白蛋白有显著降低。3.联用组与单纯西药降糖药物治疗组间不良反应发生率不存在显著差异。　　二、甘地胶囊化学物质基础研究　　1、甘地胶囊吸收入血成分分析：　　甘地胶囊成分目前尚不清楚，尤其是口服后吸收入血的成分研究更为少见。为此建立了UHPLC-Q-TOF/MS方法分离鉴定甘地胶囊中的主要成分，采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流速为0.4ml?min-1；流动相为0.1%甲酸（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序在19分钟内从5%到95%B。在每次分析后，后运行10分钟再回到初始流动相。进样体积为5μL，柱温为25℃。　　结合前期构建的甘地胶囊化学成分数据库，对甘地胶囊样品溶液所得色谱图上色谱峰进行定性分析。　　方法建立后，对甘地胶囊化学成分进行系统分析；构建体外Caco-2单层细胞吸收模型，给药甘地胶囊提取液后，分析测定吸收成分；大鼠灌胃甘地胶囊提取液，分析测定大鼠血浆中化学成分，筛选吸收入血的主要成分。　　本部分结果显示：在甘地胶囊提取物中发现52种组分；建立Caco-2细胞模拟药物分子体内吸收模型，检测出甘地胶囊中可以被肠道上皮细胞吸收的17种成分，共有17个组分能从Caco-2细胞的根尖侧渗透到基底外侧，其表观渗透系数Papp＞1×10-5cm／s，具有良好的肠道通透性和生物利用度。通过大鼠体内入血成分分析，检测出甘地胶囊中可以被吸收进入血液循环的14种成分，全部包含在17种能透过Caco-2单分子层模型的成分中。证实了将Caco-2单层细胞模型与UHPLC-Q-TOF/MS相结合的策略对于快速筛选甘地胶囊入血的成分是可靠的，可进一步应用于其它中药复方和复杂的化学样品的研究。　　2、甘地胶囊质量标准方法的建立　　近年来中药质量标准有了进一步发展，要求中药复方制剂中多种成分进行定量测定，以加强其质量控制，为此建立甘地胶囊中野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩素、芦丁、黄芪甲苷5种成分的UHPLC/MS测定方法。　　实验采用Zorbax SB-C18（2.1×50mm，1.8μm）柱，流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速：0.35mL/min，检测波长254nm，柱温25℃，进样量5μL。质谱采用电喷雾离子源（ESI），多反应离子监测模式（MRM），结合正负离子扫描切换的检测方法.　　采用电喷雾离子源（ESI），多反应离子监测（MRM），结合正负离子扫描切换，其中野黄芩苷采用负离子模式检测，黄芪甲苷、黄芩苷、汉黄芩素、芦丁采用正离子模式检测。　　结果显示野黄芩苷、黄芩苷、黄芪甲苷、汉黄芩素、芦丁的定量限分别为0.48ng/mL、0.31ng/mL、1.31ng/mL、0.11ng/mL和0.22ng/mL，检测限分别为0.14ng/mL、0.092ng/mL、0.39ng/mL、0.033ng/mL、0.12ng/mL。　　在相应的线性范围内R2＞0.99；日内和日间精密度（RSD）均小于5%，平均回收率均在87.87%-122.47%。最后对甘地胶囊18个批次进行含量测定，结果显示各个批次含量有较明显差别，同时随着时间推移，含量有下降趋势，对甘地胶囊质量控制、稳定性考察及有效期的确定具有一定的参考意义。　　结果显示本定量方法各分析方法学验证参数皆在考察范围内，具有简单、快速、灵敏、准确的特点，同时考虑了甘地胶囊的药物稳定性，可用于甘地胶囊中五种主要成分的含量测定，为该药的质量控制提供依据。　　三、甘地胶囊治疗糖尿病肾病的代谢组学研究　　在甘地胶囊临床疗效、体内外化学成分明确的基础上，采用UPLC-Q-TOF/MS代谢组学的方法，研究甘地胶囊给药组和对照组病人血清和尿液的代谢轮廓变化，并采用多元统计分析方法偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）筛选了甘地胶囊治疗6个月后患者血清和尿液代谢标志物发生的变化。　　结果表明，UPLC-MS血清数据集含有579个峰，尿液的数据集则含有998个峰。数据的统计性能参数为R2X=0.695，R2Y=0.977，预测参数为Q2=0.719，这些参数表明这两个模型都具有高度的有效预测能力。基于空白组和甘地胶囊给药6个月组两个数据集建立的PLS-DA模型的分类敏感性达到了100%，特异性同样达到了100%。　　在UPLC-Q-TOF/MS血清和尿液的数据中分别筛选到18个和19个代谢物作为潜在生物标志物，其中血清中的潜在代谢生物标志物主要是长链脂肪酸等脂质代谢物，还包含嘌呤、肌酐和等，尿液中的潜在代谢生物标志物主要是氨基酸、有机酸、嘌呤和鞘氨醇等。其中，脂质类代谢物在血清中占到12个，氨基酸类代谢物在尿液中占到10个，是两种样本中最典型的代谢生物标志物。　　采用IPA分析方法对关键代谢通路进行富集，并获得五条主要的代谢通路。富集效率最高的通路是嘌呤代谢途径，其次是磷脂代谢途径。嘌呤、甘油磷脂和苯丙氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺代谢，是甘地胶囊发挥治疗糖尿病肾病药效作用，调控机体代谢水平的关键途径。　　四、基于网络药理学的甘地胶囊治疗糖尿病肾病的多成分多靶点协同机制的研究　　为了确认甘地胶囊治疗糖尿病肾病的潜在协同机制，采用了网络药理学策略来探究甘地胶囊中的活性靶点。建立了一个含有315种成分分子的甘地胶囊成分库和含有155种靶点蛋白的糖尿病肾病靶点库。根据在UniprotKB数据库中的PDB代码，从甘地胶囊主要成分中挑选出了六种代表性的成分分子，并将该六种分子与99种蛋白进行对接，建立成分分子与靶点的相互作用网络图。结果显示有47种蛋白与甘地胶囊中至少一种成分分子有高亲和力。与糖尿病肾病高度相关的活性通路主要是TGF-β1,AMPK,胰岛素,TNF-α和脂质代谢通路。在相互作用网络中，蛋白ACC1、SOD2、COX2、PKC-B、IR和ROCK1与六种成分有最广泛的相互作用。随后运用表面等离子共振和酶活性测试的方法对竞争性的成分-蛋白相互作用进行实验性验证，结果显示汉黄芩素与COX-2、SOD2、黄芪甲苷与ACC1，莫诺苷与ACC1有相互作用关系。得出结论，甘地胶囊在糖尿病肾病联合治疗中的潜在协同机制是通过与多种蛋白相互作用，从而介导多种通路实现的。　　总之，通过本课题的四个部分研究，初步明确了甘地胶囊治疗糖尿病肾病微血管病变的物质基础与协同作用机制。1).在临床评价研究部分共完成糖尿病肾病受试者60例，服用甘地胶囊2个疗程以上，可以显著降低患者的24h尿微量白蛋白量；2).构建甘地胶囊的体外体内检测方法，明确了甘地胶囊体外的主要成分，筛选出吸收入血的17种主要成分，同时建立了5种主要成分的多成分含量测定方法；3).利用代谢组学技术筛选了甘地胶囊血清和尿液的代谢标志物，采用IPA分析确定了糖尿病肾病相关的富集代谢通路5条。4).采用网络药理学技术构建了多成分与多靶点的相互作用网络图，探讨了甘地胶囊治疗糖尿病肾病的协同分子机制，验证了COX-2、SOD2、ACC1等甘地胶囊在体内发挥药效的关键靶点。本研究在甘地胶囊临床药效确证的基础上，对甘地胶囊体内外的化学物质基础进行的全面分析，进一步利用临床样本，开展了探索性的代谢组学和网络药理学研究，阐释了甘地胶囊发挥治疗糖尿病肾病微血管病变的物质基础和协同分子机制，为甘地胶囊的临床广泛应用奠定了扎实的理论基础，同时也为该复方的二次开发提供了科学依据。