灵芝(Ganoderma lucidum(curtis:Fr.)P.Karst.)在我国已有悠久的应用历史,可用于多种疾病的治疗。灵芝的化学、药理和临床等现代研究也证明灵芝具有抑制肿瘤、保肝、调节血压、降血糖、抗病毒、延缓衰老、抗炎等多种作用,其中灵芝的抗肿瘤作用更是近年来的热点。由于灵芝的化学成分十分复杂,难以得到纯化合物进行抗肿瘤活性及其作用机制的研究,限制了灵芝产业的深入发展。本研究室运用分离纯化与体外筛选模型相结合的方法,分别得到提高免疫功能的活性成分GLIS和诱导细胞凋亡的有效部位GLAI,本论文在前人工作的基础上对它们的作用机制进行探讨,为将来的进一步研究和开发建立了基础。1.灵芝多糖GLIS的免疫刺激活性研究灵芝多糖GLIS是经过多步色谱分离纯化得到的糖蛋白组分,以前的研究发现GLIS可以激活淋巴细胞,并能够特异性地刺激淋巴B细胞增殖,增加NK细胞的活性。本论文在前人工作的基础上,探讨了GLIS对小鼠巨噬细胞株RAw264.7、小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMMs)和小鼠淋巴细胞(MSLs)的免疫调节作用,并对激活巨噬细胞的作用机理进行了研究。GLIS处理小鼠巨噬细胞株RAW264.7后,发现其形态发生了变化,如体积变大,并且形成伪足;同时发现GLIs能刺激RAW264.7细胞呼吸爆发,产生大量活性氧,并刺激RAW264.7细胞释放NO,两项实验结果证明GLIS可激活免疫巨噬细胞的氧依赖杀伤机制;GLIS还刺激RAW264.7细胞增加IL-1β、IL-12p35和IL-12p40细胞因子mRNA的表达,而细胞因子TNF-α、IL-6和IL-18 mRNA的表达则基本无变化;另外还发现其分泌TNF-α、IL-1β和IL-12细胞因子的量明显增加。GLIS处理小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMMs)后,也发现其体积变大,并且形成伪足;同时GLIS也能刺激BMMs呼吸爆发,产生大量活性氧;并刺激BMMs释放NO,结果与RAW264.7细胞株实验相同;GLIS刺激BMMs后相关细胞因子的表达也增加,在mRNA水平,IL-6、IL-12p35和IL-12p40明显增加,TNF-α、IL-1β和IL-18也有所增加。在蛋白水平,TNF-α、IL-1β和IL-12三种细胞因子的表达明显增加。GLIS还可以可刺激淋巴细胞增殖,并且可刺激其呼吸爆发。研究结果显示GLIS通过激活巨噬细胞氧依赖杀伤系统及刺激其表达细胞因子达到全面激活免疫功能进行抗肿瘤的目的。2.灵芝三萜GLAI诱导肠癌细胞凋亡作用研究灵芝三萜GLAI是通过活性跟踪经多步分离纯化从灵芝子实体中分离得到的一个有效部位,对GLAI的理化性质研究发现,其三萜含量为62.8%;HPLC检测发现GLAI含有8个峰,其中有两个峰确定为灵芝酮二醇和丹芝醇A。GLAI对多种肿瘤细胞株具有抑制活性,包括小鼠淋巴癌L1210细胞株、人淋巴癌K562细胞株、人肠癌SW620细胞株和人乳腺癌MCF7细胞株。GLAI处理SW620细胞后,其细胞形态出现明显的变化,细胞变圆、皱缩,体积变小,并可观察到凋亡小体的产生;经过Hoechst 3258荧光染色和annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测,证明SW620细胞发生了凋亡:研究还发现,GLAI处理SW620细胞后,凋亡关键酶Caspase-3的活性明显增高;同时发现,随着药物浓度和作用时间的增加,凋亡抑制基因BCL-2 mRNA的表达,逐渐减少;而凋亡促进基因BAX mRNA的表达随之增加;另外发现,凋亡重要相关因子P53蛋白的表达随着药物浓度的增加而增加,而凋亡抑制蛋白XIAP则随着浓度的增加而减少。研究结果显示GLAI能够通过激活Caspase-3酶途径诱导肠癌细胞SW620凋亡,同时通过上调凋亡促进因子的表达,下调凋亡抑制因子的表达达到诱导SW620细胞凋亡的效果。综上所述,灵芝的抗肿瘤作用一方面是通过灵芝多糖激活免疫细胞,通过提高免疫系统的能力来达到消除肿瘤的目的;另一方面是通过灵芝三萜诱导肿瘤细胞凋亡,从而达到消除肿瘤的效果。因此灵芝的抗肿瘤作用可能是多途径共同作用的结果。