拟南芥芥子酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性研究

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十字花科植物广泛分布于自然界中,由于它们体内含有特殊的硫代葡萄糖苷/芥子酶防御系统,近年来,正受到越来越多研究者的关注。在植物体内,硫代葡萄糖苷和芥子酶分别位于不同的细胞中,或者位于同一细胞的不同细胞结构中。当植物体受到机械损伤、昆虫攻击或受到真菌和病原体的感染时,芥子酶和硫代葡糖苷相遇,将硫代葡糖苷降解成异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈类或坏硫腈、唑烷-2-硫酮等物质。研究认为,硫代葡萄糖苷及其水解产物在营养储备、植物防御、植物生长发育、抗癌、风味形成等方面具有特殊的作用。   目前在拟南芥中共发现了6个芥子酶基因,分别是TGG1,TGG2,TGG3,TGG4,TGG5和TGG6,它们在拟南芥中的表达具有组织特异性。TGG1和TGG2在叶、子叶、茎和花器官中表达,而TGG4、TGG5在根部特异表达。TGG3是一个假基因,它在雄蕾和花瓣中特异表达,TGG6同TGG3类似,在编码区有移码突变,不能编码完整多肽,为花特异表达的假基因。   本实验克隆拟南芥芥子酶基因TGG1,利用毕氏酵母表达。重组蛋白用镍亲和柱纯化,获得高纯度芥子酶。重组蛋白分子量78kD,与天然TGG1分子量接近,为糖基化蛋白。TGG1信号肽在酵母中具有分泌功能,约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重组蛋白具有广泛的pH适应性,最适反应温度40℃左右。活性被低浓度维生素C激活,被高浓度维生素C抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组蛋白以Sinigrin为底物时,Km为65μmol/L,最大反应速率Vmax=3.28μmol·min-1·mg-1。
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