熟地、肉苁蓉超滤膜提取物对氯化镉诱导BMSCs微核率、染色体畸变率及凋亡的影响

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目的:通过应用不同浓度的氯化镉(cadmium chloride,CdCl2)孵育小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),观察细胞形态及增殖情况,筛选出CdCl2抑制BMSCs生长的最佳浓度及时间;应用补益中药熟地(rehmannia glutinosa)及肉苁蓉(desertliving cistanche)超滤膜提取物作用于CdCl2诱导的BMSCs,探讨熟地及肉苁蓉对BMSCs的遗传稳定性及凋亡的作用,为中药联合BMSCs的临床应用提供实验依据。  方法:用含有50umol/L、100 umol/L、200 umol/L、400 umol/L、800 umol/L CdCl2的DMEM-F12培养液作用于密度为1×104个/mL的小鼠BMSCs24 h、48 h、72 h,通过倒置相差显微镜观察不同浓度 CdCl2诱导小鼠BMSCs的细胞形态,用MTT法检测CdCl2抑制小鼠BMSCs细胞的增殖情况,筛选出最佳作用浓度及时间,同时设正常BMSCs对照组。用水提法结合超滤法制备熟地、肉苁蓉不同分子量段提取物:分子量10,000以下、10,000-100,000及100,000-200,000三部分;将实验一筛选所得最佳CdCl2浓度作用于BMSCs,随机分为CdCl2诱导的BMSCs染毒模型组,熟地、肉苁蓉各段提取物干预组,作用24h,通过微核实验、染色体分析及流式细胞仪分别观察CdCl2对BMSCs细胞微核率、染色体畸变率及细胞凋亡的影响。  结果:实验结果提示浓度50-800 umol/L的CdCl2可对BMSCs有明显的抑制作用,通过改良寇氏法计算IC50确定出CdCl2对BMSCs抑制作用最佳的浓度为400 umol/L,最佳作用时间为24h。显微镜下观察,对照组细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,胞体透亮,折光性强;CdCl2诱导组细胞呈凸起回缩,细胞变小、变圆,贴壁不牢,悬浮细胞增多。通过微核实验观察细胞微核数及计算细胞微核率发现,与对照组比较,分子量10,000以下、10,000-100,000、100,000-200,000的熟地及肉苁蓉超滤膜提取物均可以减小CdCl2诱导的BMSCs微核数及微核率,均以分子量10,000以下提取物效果最为明显(p<0.05);与不加中药有效成分的对照组相比差异均具显著性(p<0.05)。通过染色体分析观察细胞染色体畸变率发现,与对照组比较,分子量10,000以下、10,000-100,000、100,000-200,000的熟地及肉苁蓉超滤膜提取物均可以减小 CdCl2诱导的BMSCs染色体畸变率的发生,均以分子量10,000以下提取物效果最为明显(p<0.05);与不加中药有效成分的对照组相比差异均具显著性(p<0.05)。通过流式细胞术测试细胞凋亡发现,与对照组比较,分子量10,000以下、10,000-100,000、100,000-200,000的熟地及肉苁蓉超滤膜提取物组均可以降低CdCl2诱导的BMSCs的凋亡率,其中在各组肉苁蓉超滤膜提取物中以分子量10,000以下提取物效果最明显(p<0.05);与不加中药有效成分的对照组相比差异均具显著性(p<0.05)。  结论:本研究发现 CdCl2可以诱导 BMSCs出现细胞微核和染色体畸变以及细胞的凋亡,可以导致BMSCs遗传物质损伤,中药熟地和肉苁蓉提取物可以通过减少细胞的凋亡来降低BMSCs的微核率和染色体畸变率,以提高BMSCs的遗传稳定性。
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