论文部分内容阅读
目的:明确核因子K B受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand,RANKL)对软骨的直接作用及作用机制,为关节软骨退变的治疗提供新思路。方法:体外细胞实验选用软骨细胞株ATDC5,以明确RANKL对软骨细胞的直接作用。体外培养采用牛软骨片,以明确RANKL对软骨组织的直接作用。体内动物实验采用C57BL/6J小鼠,以明确RANKL在体内对关节软骨的作用。第一部分:RT-PCR检测正常软骨细胞中核因子κ B受体活化因子(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B,RANK)和 RANKL 的表达,RT-qPCR 检测软骨细胞ATDC5在分化过程中Col2a1、Co110a、OPG、SOX9、RANK和RANKL的时空表达,Western蛋白印迹检测RANKL刺激后ATDC5细胞中RANK的表达变化,H&E、Alcian Blue和Safranin 0染色及Markin评分分析RANKL刺激对软骨细胞或组织的直接作用。第二部分:RT-qPCR 检测 RANKL 刺激后 ATDC5 细胞 Col2a1、MMP9、MMP13、ADAMTS5的时空表达变化,Western蛋白印迹检测RANKL刺激后MMP13、ADAMTS5的时空表达变化,不同浓度的RANKL刺激对ADAMTS5表达的影响,及RANKL刺激0～120分钟内总IKB-α和磷酸化的IKB-α的表达变化。免疫荧光和激光共聚焦观察p65的入核情况。IKB-α特异性抑制剂选用BAY11-7082。RANK沉默选用小干扰RNA。第三部分:Micro-CT检测关节腔RANKL后胫骨骨体积分数的变化,RT-qPCR检测股骨TRAP、Col2a1和Col10a的表达情况,H&E染色分析关节软骨的形态变化情况,免疫组织化学染色检测Col2a1、Col10a、MMP9、MMP13、OPG、RANKL和ADAMTS5等蛋白的表达变化。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:1)软骨细胞可以表达RANK及RANKL。在软骨分化过程中,RANKL和RANK的表达随时间增多。外源性RANKL刺激可以使软骨细胞的RANK表达上调。外源性的RANKL刺激可导致软骨结构紊乱,蛋白多糖丢失,Markin评分升高(P<0.05)2)相对于对照组,RANKL刺激ATDC5细胞后,与软骨退变相关的MMP9、MMP13和ADAMTS5的表达显著升高,且有浓度依赖性;而软骨标志因子II型胶原和X型胶原的mRNA水平显著下降(P<0.05)。RANKL刺激后细胞中总IKB-α的表达随时间表达下降,磷酸化IKB-α开始随时间表达增多,在30min表达达到峰值,随后下降。免疫荧光染色后,激光共聚焦观察到P65在30min时有明显的入核。加入IKB-α特异性抑制剂BAY11-7082后,再次加入RANKL刺激ADAMTS5的表达增量随着抑制剂浓度增加而下降。RANK沉默后,ADAMTS5的上调也不再观察到。3)关节腔内注射RANKL可以引起骨体积分数下降、Col2a1和Col10a的表达下降及TRAP的表达升高。H&E染色显示软骨层空泡的出现及软骨细胞数目的减少。免疫组织化学染色显示,与软骨标志蛋白Co12a、Col10a的表达下降,而与软骨退化相关的ADAMTS5、MMP9、MMP13表达升高。与此同时,RANKL表达升高,而OPG的表达下降。结论:RANKL可以通过NFκ B信号通路来上调ADAMTS5的表达,直接导致软骨退行性变。因此,可以以RANKL-NFκB-ADAMTS5信号轴为干预靶点,作为预防和治疗关节软骨退变的新途径。