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目的:观察HBV X蛋白在NK细胞中的表达及其对NK细胞功能的影响,从而为乙型肝炎慢性化机制的研究提供新的思路。
方法:已经构建好的HBV X基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBX经双酶切及测序鉴定,证实该重组真核表达质粒含有所需目的基因。然后,通过脂质体转染法将其转入NK-92细胞;48h后,通过RT-PCR和Western blotting分别检测HBV X基因在NK-92细胞中的mRNA和HBV X蛋白的表达情况;用Western blotting检测NK-92细胞表面NKG2D的表达水平;通过MTT比色法检测NK-92细胞对HepG2细胞的细胞毒作用;用ELISA法检测NK-92细胞分泌的IFN-γ水平。
结果:经酶切和测序鉴定证实,所得pcDNA3.1(+)-HBX载体结构正确,目的片断与GeneBank中HBV X基因完全符合,没有发生突变。RT-PCR结果显示,从转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞中可以扩增出长度为192bp的目的片断,而在pcDNA3.1(+)空载体转染组和未转染组没有发现目的条带。Western blotting结果表明,pcDNA3.1(+)-HBX转染NK-92细胞后,可在NK-92细胞中表达大小约为17KDa的X蛋白,并且可以和特异性HBx单克隆抗体结合。NKG2D Western blotting结果表明与空质粒对照组和空白对照组相比,转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞NKG2D表达水平明显降低(P<0.01)。MTT比色法结果显示与两个对照组相比,转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞对于HepG2细胞的细胞毒活性有所降低,差异具有显著性(P<0.01)。ELISA实验表明,转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞分泌IFN-γ的水平也较上述两对照组降低,差异具有显著性(P<0.01)。
结论:1、pcDNA3.1(+)-HBX载体可以通过脂质体法转染到NK细胞中,并且在其中成功表达。
2、HBV X基因瞬时高表达可以降低NK-92细胞表面NKG2D的表达。
3、HBV X基因瞬时高表达使NK-92细胞毒功能减弱。
4、HBV X基因瞬时高表达使NK-92细胞分泌IFN-γ减少。
方法:已经构建好的HBV X基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBX经双酶切及测序鉴定,证实该重组真核表达质粒含有所需目的基因。然后,通过脂质体转染法将其转入NK-92细胞;48h后,通过RT-PCR和Western blotting分别检测HBV X基因在NK-92细胞中的mRNA和HBV X蛋白的表达情况;用Western blotting检测NK-92细胞表面NKG2D的表达水平;通过MTT比色法检测NK-92细胞对HepG2细胞的细胞毒作用;用ELISA法检测NK-92细胞分泌的IFN-γ水平。
结果:经酶切和测序鉴定证实,所得pcDNA3.1(+)-HBX载体结构正确,目的片断与GeneBank中HBV X基因完全符合,没有发生突变。RT-PCR结果显示,从转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞中可以扩增出长度为192bp的目的片断,而在pcDNA3.1(+)空载体转染组和未转染组没有发现目的条带。Western blotting结果表明,pcDNA3.1(+)-HBX转染NK-92细胞后,可在NK-92细胞中表达大小约为17KDa的X蛋白,并且可以和特异性HBx单克隆抗体结合。NKG2D Western blotting结果表明与空质粒对照组和空白对照组相比,转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞NKG2D表达水平明显降低(P<0.01)。MTT比色法结果显示与两个对照组相比,转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞对于HepG2细胞的细胞毒活性有所降低,差异具有显著性(P<0.01)。ELISA实验表明,转染了pcDNA3.1(+)-HBX的NK-92细胞分泌IFN-γ的水平也较上述两对照组降低,差异具有显著性(P<0.01)。
结论:1、pcDNA3.1(+)-HBX载体可以通过脂质体法转染到NK细胞中,并且在其中成功表达。
2、HBV X基因瞬时高表达可以降低NK-92细胞表面NKG2D的表达。
3、HBV X基因瞬时高表达使NK-92细胞毒功能减弱。
4、HBV X基因瞬时高表达使NK-92细胞分泌IFN-γ减少。