目的:双黄连方药由金银花、连翘、黄芩配伍而成,是目前临床治疗呼吸道感染性疾病的代表方剂之一,疗效显著,有三十多年临床用药历史,在禽流感、SARS等烈性呼吸道传染性疾病的治疗中也发挥了重要作用,具有清热解毒,清宣透散之功,现代药理研究表明双黄连方药具有广谱抗病毒和抗菌效果,但双黄连的抗病毒物质基础研究尚不够充分,制约了该方药的二次开发,阐明该方药的抗病毒物质基础仍是双黄连方药继续向前发展的关键所在。方法:（1）高效液相色谱电喷雾串联质谱法全面分析双黄连粉针剂及其各组成药材提取物中化学成分,对其进行初步的定性分析,并对其药味来源进行归属。双黄连粉针为哈尔滨中药二厂生产,各组成药材按2005版中国药典中双黄连口服液工艺进行提取,液质联用条件为:色谱柱:Aglient Zorbax Extend C18柱（50×4.6 mm,1.8μm）;流动相:A（0.25%醋酸水溶液）-B（甲醇）梯度洗脱:0 min～5 min（B:15%→35%）,5 min→7 min（B:35%）,7 min～30 min（B:35%→100%）;流速:0.6 ml/mim进样量:5μl,检测波长:350nm。质谱条件:电喷雾电离源（ESI源）,碰撞能100V,干燥气温度350℃,干燥气流速:11 L/min,雾化气压力40psi,负离子扫描,扫描范围m/z 50～1000。将各供试液上机分析,对各色谱峰的质谱信号进行分析,对化合物进行初步定性。（2）优选大孔树脂对双黄连方药的组成药材金银花、连翘进行大孔树脂分离,并对各提取分离部位化学成分进行定性分析,对指标成分进行定量分析。（3）以阳性药物利巴韦林注射液作为对照,对各提取分离部位进行体外抗呼吸道合胞病毒活性评价,实验重复3次。药物毒性实验方法:Hela细胞常规传代培养,待长满后用胰酶消化,含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞悬液,以8×10⁵个/ml的细胞密度,加入96孔板中,每孔200μl,37℃,5%CO₂孵箱中培养24h,待细胞长成单层。吸出培养液,加入各浓度药液200μl,每个浓度8个复孔。正常对照只加入等体积2%小牛血清的细胞维持液。37℃,5%CO₂孵箱中培养,每24小时观察细胞病变情况（CPE）,连续观察72h,记录实验结果。72h后,将药液吸出,每孔加入5 mg/mlMTT（用PBS配制）200μl,37℃,5%CO₂孵箱中孵育2h后,弃上清,每孔加入DMSO200μl,室温下振荡混匀10min,在490nm下,酶联免疫检测仪测定吸光度值,并计算细胞存活率。采用SPSS13.0统计软件,Regression-probit回归将药物浓度与细胞存活率进行回归分析,计算细胞半数存活浓度(TC₅₀)。呼吸道合胞病毒（RSV）毒力测定:采用TCID₅₀微量法,用Reed-Munch公式计算TCID₅₀。药物抗病毒实验方法:药物在无毒浓度范围内,用含2%小牛血清的细胞维持液对药物进行倍比稀释,加入病毒液使病毒浓度为100TCID₅₀,混匀,阳性对照药为利巴韦林注射液（0.1 g/ml）,用2%细胞维持液稀释,并加入病毒液,使利巴韦林终浓度为100μg/ml,病毒终浓度为100TCID₅₀,于37℃,5%CO₂孵箱中孵育1h。已长成单层Hela细胞的96孔板,吸掉培养液,每孔接种200μl各浓度药液与病毒的混合液,每个浓度8个复孔,同时设阳性对照组,病毒对照组和正常对照组,37℃,5%CO₂培养2h后,将药物组和病毒组液体吸出,加入细胞维持液继续培养,每日观察CPE。72h后将药液吸出,每孔加入5 mg/ml MTT（用PBS配制）200μl,37℃,5%CO₂孵箱中孵育2h后,弃上清,每孔加入DMSO 200μl,室温下振荡混匀10min,在490nm下,酶联免疫检测仪测定吸光度值。并计算药物对病毒的抑制率。采用SPSS13.0统计软件,Regression-probit回归将药物浓度与病毒抑制率进行回归分析,计算药物的半数有效浓度IC₅₀。并计算治疗指数TI。采用SPSS13.0统计软件,One-Way ANOVA对各药物不同浓度组、阳性对照组、病毒对照组、正常对照组间吸光度均数进行方差分析及组间多重比较,确定各药物组间及其与对照组间病毒抑制率是否有显著性差异。（4）通过分析抗病毒活性部位成分、对比其与双黄连粉针中化学成分差异,寻找相关抗病毒物质基础。结果:（1）对双黄连粉针及各药材提取物中各色谱峰的质谱信号进行分析,推断化合物分子量,通过标准品对照、谱图中碎片离子结构分析及文献查阅,从双黄连粉针中共检测出30个色谱峰,其中鉴定了26个化学成分;从金银花提取物中检测出21个色谱峰,鉴定了18个化学成分;从连翘提取物中检测出23个色谱峰,鉴定了11个化学成分;从黄芩提取物中检测出5个色谱峰,鉴定了4个化学成分;从金银花连翘合煎提取物中检测出24个色谱峰,鉴定了22个化学成分。（2）通过各谱图间的比较,对双黄连粉针中各色谱峰进行药味归属。双黄连粉针总离子流图中共检测到30个色谱峰,其中14个峰来自金银花,主要为绿原酸、异绿原酸及其同分异构体等化合物;10个峰来自连翘,主要为连翘酯苷及其同分异构体等化合物;5个峰来自黄芩,主要为黄芩苷等黄酮类化合物;另有4个峰从各药味中找不到归属,推测可能与以下因素有关:中药材的化学成分与产地及季节有一定的依赖关系,实验所用的3个药材,与双黄连粉针生产厂所用原料,虽然品种一致,但来源不同,因此在成分上可能存在差异;是生产过程中化合物间的相互作用或分解等产生的新的化合物。对比金银花提取物,连翘提取物,及金银花连翘合煎提取物的总离子流图,发现金银花单煎提取物中有4个绿原酸的同分异构体,而金银花连翘合煎只有2个绿原酸的同分异构体,推测可能是绿原酸在合煎条件下比单煎稳定,连翘单煎提取物中的3、4、5、6,12号峰在金银花连翘合煎提取物中不明显,说明金银花连翘合煎与两药材单煎在物质基础上存在一定差异。对比连翘提取物、金银花连翘合煎提取物及双黄连粉针的总离子流图,发现连翘提取物中的9,10号峰在双黄连粉针中消失,但在金银花连翘合煎提取物中能找到这两个峰的归属,说明这两个峰的消失应该与双黄连粉针进一步的生产制备工艺有关。两个峰[M-H]^-。离子m/z均为639,推测其应该是连翘酯苷及其同分异构体β-hydroxyfosythiaside,考察其分子结构比连翘酯苷A多一个羟基,可能失去一分子水并发生双键还原反应[M+2H-H₂O-H]^-而变成m/z623,在双黄连粉针中17号峰[M-H]^-离子m/z为623,为连翘酯苷A的同分异构体,且从各单味药中找不到归属,是否由连翘酯苷C反应得来,需进一步验证;双黄连粉针中6号峰[M-H]^-为m/z461,响应值较高,推测其为连翘酯苷E,在连翘提取物中能找到对应峰,但连翘提取物中的m/z461响应值较低,本研究认为如果是连翘中已含有的连翘酯苷E,在双黄连粉针中的响应值不应该明显增大,考虑到连翘酯苷分子结构不稳定,容易失去一个咖啡酰基[M-H-162]^-而得到连翘酯苷Em/z461,因此推测双黄连粉针中的m/z461峰的显著增大可能由连翘酯苷A失去咖啡酰基引起。（3）通过以上各谱图间的对比分析及对各色谱峰的初步定性,可以看出双黄连粉针是一个非常复杂的化合物组群,其中许多化合物均以同系物或同分异构体的形式存在,首次确定了双黄连粉针中绿原酸类化合物有3个单咖啡酰奎尼酸的同分异构体（4,7,8号峰）和3个双咖啡酰奎尼酸的同分异构体（17,18,22号峰）;首次检测出双黄连粉针中同时存在着连翘酯苷A（m/z为623）的3个同分异构体（13,17,18号峰）,都有相同的碎片离子m/z 461,推测其由m/z623脱咖啡酰基得来。其中13和18号峰可以在单味连翘提取物及金银花连翘合煎提取物中找到归属,目前文献报道的连翘中分子量为624的苯乙醇苷只有连翘酯苷A和阿克替苷（acteoside）两个（两个化合物具有相同的母核和取代基,但取代基位置不同）经标准品对照,确定18号峰为连翘酯苷A,因此13号峰应为阿克替苷。17号峰则不能从上述组成药材中找到归属,是否由连翘酯苷C反应得来,需进一步实验验证。中药理论认为中药中通常存在一类结构类似的化合物,共同发挥药效作用,从此实验结果可以确认中药中确实存在着这样的结构类似的化合物群。同时可以看到全方化学成分绝非各单味药材化学成分的简单叠加,在生产过程中,受到工艺条件、化合物间相互作用等各种因素的影响,通常有新的化合物产生。在双黄连粉针、金银花提取物及金银花连翘合煎提取物中均存在一个响应值很高的m/z191峰（1号峰）,经理论推断和标准品对照,证实其为奎尼酸,为首次报道双黄连粉针中存在奎尼酸,奎尼酸应该不是来自绿原酸的水解,而是来源于金银花。（4）经大孔树脂分离,金银花得到3个分离部位A、B、C,各部位成分基本无重叠,其中A部位主要为绿原酸及其同分异构体等成分;B部位主要为异绿原酸及其同分异构体等成分;C部位分子量相对较大,尚未鉴定出为哪些成分。连翘得到3个分离部位A′、B′、C′,各部位成分无重叠,其中A′部位成分未能鉴定,B′部位主要为连翘酯苷及其同分异构体、芦丁等成分,C部位成分未能鉴定。（5）对各分离部位、黄芩精制物、双黄连粉针等共10个药物进行体外抗呼吸道合胞病毒活性筛选,结果金银花A部位表现出较好的抗病毒活性,TC₅₀=8.125 mg/ml,IC₅₀=0.0423 mg/ml,治疗指数TI=192.1;B部位抗病毒活性较弱,TC₅₀=87.61 mg/ml,IC₅₀=4.529 mg/ml,治疗指数TI=19.34;C部位未表现出抗病毒活性;连翘A′部位抗病毒活性较弱,TC₅₀=27.46mg/ml,IC₅₀=1.705mg/ml,治疗指数TI=16.11;B′部位表现出很好的抗病毒活性,优于阳性药物,TC₅₀=12.41mg/ml,IC₅₀=0.00509 mg/ml,治疗指数TI=2438.11;C′部位表现出很好的抗病毒活性,TC₅₀=31.487mg/ml,IC₅₀=0.0167mg/ml,治疗指数TI=1885.45;黄芩精制物表现出较好的抗病毒活性,TC₅₀=0.2188mg/ml,IC₅₀=0.00332mg/ml,治疗指数TI=65.90;双黄连粉针表现出很好的抗病毒活性,TC₅₀=1.1879mg/ml,IC₅₀=0.01mg/ml,治疗指数TI=114.69。结论:双黄连方药的抗病毒效果应归功于多成分的协同作用,其中金银花的A分离部位、连翘的B′、C′部位,黄芩精制部位均具有很好的抗病毒活性,各部位化学成分研究表明,主要活性成分为奎尼酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、番木鳖酸、番木鳖苷、dimethyl-secoxyloganoside、连翘酯苷A、阿克替苷、suspensaside A、芦丁、连翘酯苷C、β-hydroxyfosythiaside、松脂素-吡喃葡萄糖苷、黄芩苷等。通过本研究,从有效部位的角度明确了双黄连方药抗呼吸道合胞病毒的物质基础。中药理论认为中药中通常存在一类结构类似的化合物,共同发挥药效作用,从此实验结果可以确认中药中确实存在着这样的结构类似的化合物群,实现多成分发挥作用的协同效果,为中药复方的作用特点提供了理论依据。