论文部分内容阅读
肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属,感染后可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹性疾病、神经源性肺水肿等多种与神经系统相关的疾病。近几年在亚太地区的大流行中,出现严重中枢神经系统感染病例,甚至死亡病例,因此有关EV71病毒的致病性、致病机理、诊断及疫苗方面的研究日益受到重视。国家卫生部已于2008年5月2日决定,将手足口病纳入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。EV71为什么会导致少数重症甚至死亡病例的出现,毒力决定因子有哪些?
EV71的VP1基因编码的蛋白质是病毒重要的中和抗原决定簇,VP1基因序列除了是肠道病毒属内不同血清型分类的依据,还可以作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。研究表明EV71的11个病毒蛋白中,对酵母菌产生毒性的只有2A蛋白,而2A蛋白是水解酶,在正常的生理意义下,哺乳细胞被肠病毒感染后,宿主的生长会受到抑制,其中一个机制就是:2A蛋白切割分解宿主的真核生物起始因子4G(eIF4G,eukaryotic translation initiation factor4G),因而抑制宿主蛋白质合成。也有报道指出,小儿麻痹病毒的2A蛋白会抑制酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞生长,可能的原因是2A切割了一些用来进行转录的蛋白质因子。短暂的表达EV712A蛋白酶引起细胞凋亡,感染表达的EV712A会导致eIF4G I的裂解,而eIF4GI是宿主蛋白合成的关键因素。
目的：
本课题旨在研究肠道病毒71型轻症和重症病例毒株VP1基因、2A基因的核苷酸序列及预测的2A蛋白质结构特征及是否有差别。
方法：
通过RD细胞分离病毒,然后RT-PCR.鉴别诊断EV71,分别扩增VP1、2A基因并进行核苷酸序列测定,用DNAMAN软件进行同源性比较并构建系统发生树,通过同源建模用chimera软件将2A氨基酸序列预测出蛋白空间结构模拟图,探讨二级、三级结构是否有差异。克隆2A基因并构建EV712A基因的重组表达质粒pIRES2-EGFP-2A。
结果：
1.RD细胞的培养及病毒分离:成功培养RD细胞,无污染,接种后肠道病毒的致细胞病变(CPE)表现为:细胞圆缩、胞浆颗粒化、核固缩以及最后细胞破裂。
2.RT-PCR鉴别诊断EV71:50份临床手足口病标本中有30份检测是EV71,其中轻型(手足口)13份,重型(手足口并发脑炎或心肌炎)17份。
3.VP1、2A基因的扩增:5株轻症和5株重症的标本经EV71 VP1、2A基因特异性引物扩增,产物分别为1082 bp、539 bp。
4.EV71病毒VP1、2A基因核苷酸序列测定与同源性比较、构建系统发生树:对扩增正确的10份PCR产物进行VP1基因和2A基因测序和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此10株EV71病毒和中国大陆已发表的5株EV71病毒(fuyangEU703814.1、xi anHM003207.1、shandongEU753418.1、shenzhenFJ607337.1、henanGU366191.1)全部属于C基因型,且核苷酸同源性较高,VP1基因和2A基因的同源性分别在94.7％～99.4％和93.6％～99.3％范围内。本次分离的10株EV71病毒与A、B基因型代表株比较,核苷酸同源性分别为81.0％～84.6％和78.4％～82.2％,差异较大。与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,核苷酸同源性在87.8％～90.2％,差异≥10％,与已知的C4亚型代表株比较,核苷酸同源性在96.8％～99.6％,因此认为可将这10株病毒划分为C4亚型。在系统发生树上,这10株病毒形成一个较独立的分支。
5.2A蛋白空间结构模拟图:从重症57号和轻症20号的2A蛋白结构模拟图可以看出,57号有三个蛋白结构域与20号不同；其它4个重症(36、37、43、55号)和4个轻症(30、31、40、52号)患者病毒的2A蛋白结构也有一些不同,但没有发现轻、重症各自之间一致性的结构特征。
6.2A基因克隆:经过PCR扩增和核酸测序证实,已成功获得2A基因。将空的T载体转入DH5α感受态细胞获得DH5α(T)。
7.重组表达质粒pIRES2-EGFP-2A的构建:将轻、重型病例各一例分离的EV71的2A基因DNA插入pIRES2-EGFP,成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-2A,通过PCR扩增、双酶切和核酸测序已证实。
结论：
1.本次分离毒株均属于EV71 C基因亚型,且与中国大陆其他省区分离的毒株遗传关系紧密。
2.EV71 VP1、2A基因分别在经测序的10个毒株之间遗传关系紧密且轻症和重症病例毒株之间均不存在差异。
3.轻症、重症2A蛋白质二级、三级结构存在差异但未找到各自一致性的蛋白质结构特征。