食管鳞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，尤其是华北地区。虽经过多年的研究，但其发生发展的分子机制仍不十分清楚。纤毛/鞭毛是进化上非常保守的细胞器，鞭毛/纤毛不仅作为运动推动器，而且也可作为一个细胞“天线”，接收来自其他细胞和环境的物理、化学信号，向细胞核传递这些信号以引起细胞反应。纤毛结构或功能上的异常导致一系列人类疾病的发生，包括肿瘤。作为引发多条信号通路活化的重要细胞器，纤毛在肿瘤的发生中发挥重要作用，而鞭毛组装和肿瘤发生的分子机制目前还不清楚。直接以人的纤毛为对象研究纤毛的组装过程是困难的，大多数肿瘤细胞的纤毛都出现了缺失。因此我们以双鞭毛无细胞壁的单细胞真核生物——杜氏盐藻的鞭毛为模式细胞器来研究纤毛组装机制在食管鳞癌发生中的作用。　　纤毛/鞭毛是一个基于微管的细胞器，鞭毛内运输(IFT)是目前研究比较清楚的纤毛/鞭毛组装机制，但是其调控机制尚不明确。IFT的调控机制是一个精密且复杂的过程，肯定有多种调控途径存在，而蛋白的翻译后修饰是一种比较常见的调控手段。蛋白翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、多糖化、氨基乙酰化、谷氨酰基化、甲基化。研究人员推测IFT马达蛋白、IFT复合物及相关蛋白可能通过一种或多种翻译后修饰来调节马达蛋白自身的相对活性及其与IFT复合物蛋白、货物(cargo)的相互作用。实际上，研究人员已发现蛋白磷酸化和去乙酰化在衣藻鞭毛和组织细胞初级纤毛的解聚中发挥着重要作用，且微管蛋白tubulin的乙酰化、去酪氨酸化(detyrosination)、谷氨酰化(glutamylation)、甘氨酰化（glycylation）在轴丝微管的组装和维持中发挥重要作用。但是，关于纤毛/鞭毛蛋白甲基化方面的报导还比较少，Schneider等人在2008年在衣藻鞭毛重吸收过程中检测到四个轴丝蛋白不对称的双甲基化，而Sloboda等人在完整的鞭毛中发现了三个高度甲基化蛋白，但这些蛋白的功能研究还未见报道。前期的研究表明，一些小的鸟苷三磷酸酶(GTPase)和蛋白磷酸酶2A的催化亚基在细胞的信号传导中被甲基化。甲基化修饰可能会影响蛋白-蛋白的相互作用或者酶的活性，从而对信号传导和蛋白靶向的调节起关键作用。　　保守的S-腺苷同型半胱胺酸水解酶(SAHH)是甲基化途径中降解S-腺苷同型半胱胺酸(SAH)的唯一水解酶，SAH对甲基化通路具有反馈抑制作用，对SAHH的抑制会导致细胞内SAH的增多，从而导致对甲基化途径的抑制。最近，SAHH抑制剂在抗病毒抗寄生虫方面得到广泛的关注，同时，研究发现一些人类疾病的发生与细胞内SAHH水平的变化密切相关。例如，细胞内SAHH水平的异常会导致人类心血管疾病的发生，从2004年在南斯拉夫已经发现7起致死事件是由于SAHH的异常造成的，2008年Leal等人通过全基因组功能缺失筛选出五个新的推测抑癌基因，SAHH就是其中之一，研究人员发现在包括直肠癌和肺癌在内的肿瘤中SAHH表达下调。SAHH作为一个新的抑癌基因，它的抑癌作用是否与纤毛调控有直接或间接的关系呢？　　Pazour等人通过质谱分析发现莱因衣藻的SAHH的肽段存在于其鞭毛的组分中，为了研究纤毛在食管鳞癌发生中的作用，本研究以鞭毛再生过程中筛选出的差异表达基因SAHH为目的基因，从两个方面对SAHH在胞内可能发挥的功能进行了研究:1、检测SAHH在杜氏盐藻鞭毛再生过程中的作用。2、观察食管鳞癌组织和细胞株EC9706和Eca109中SAHH表达情况，构建eGFP-N1-SAHH真核过表达，并观察SAHH的过表达对食管鳞癌细胞株EC9706和Eca109的增殖、凋亡、侵袭、细胞周期及细胞形态的的影响。　　第一部分:SAHH在纤毛/鞭毛组装中的作用　　目的:　　以杜氏盐藻鞭毛为模式细胞器研究纤毛组装在食管癌发生发展中的作用，构建鞭毛再生模型，筛选鞭毛再生过程中差异表达基因，并研究其在鞭毛再生过程中的作用，为研究纤毛组装在食管鳞癌中的作用奠定基础。　　方法:　　第一章杜氏盐藻鞭毛组装模型的构建及差异基因的筛选　　1、运用pH休克的方法构建杜氏盐藻鞭毛再生过程;　　2、提取野生型和pH休克后再生1h的杜氏盐藻细胞总RNA的通过Illumina高通量测序平台对转录组进行测序、组装、注释、功能分类，并筛选出差异表达基因。　　第二章dsSAHH在杜氏盐藻鞭毛组装中的作用结果:　　1、通过RACE巢式PCR扩增筛选出来的dsSAHH全长序列;　　2、构建pET28a(+)-dsSAHH原核表达载体，诱导dsSAHH蛋白的表达并制备其抗体;　　3、通过Westernblotting和实时荧光定量PCR(real-timePCR)检测dsSAHH检测在鞭毛再生过程中蛋白水平和转录水平上的变化;　　4、间接免疫荧光法检测dsSAHH在杜氏盐藻细胞中的定位。　　5、构建p7NBT-dsSAHH真核表达载体，观察dsSAHH在杜氏盐藻细胞中的过表达对鞭毛再生的影响;　　6、通过扫描电镜观察SAHH抑制剂DZA对杜氏盐藻鞭毛再生的影响;　　7、酵母双杂技术筛选dsSAHH互作蛋白，并由体内外实验验证其相互作用。　　结果：　　第一章杜氏盐藻鞭毛组装模型的构建及差异基因的筛选　　1、运用pH休克的方法构建杜氏盐藻鞭毛再生过程;　　2、提取野生型和pH休克后再生1h的杜氏盐藻细胞总RNA的通过Illumina高通量测序平台对转录组进行测序、组装、注释、功能分类，并筛选出差异表达基因。　　第二章dsSAHH在杜氏盐藻鞭毛组装中的作用　　1、经3和5RACE扩增后，得到一个全长为1，926bp的cDNA片段，其中包括1，458bp的ORF，编码458个氨基酸，预测的分子量为52.8kD，等电点(pI)为5.70;　　2、16℃过夜培养，1mMIPTG成功诱导可溶性dsSAHH蛋白的表达，并制备其抗体，用于后续实验;　　3、Real-timePCR和westernblotting结果显示:杜氏盐藻dsSAHH基因在鞭毛再生过程中在蛋白水平和转录水平都表达上调;　　4、间接免疫荧光结果显示:dsSAHH不仅存在于细胞核和细胞质内，在鞭毛内也有定位;　　5、在dsSAHH过表达的杜氏盐藻细胞株中，pH休克后其鞭毛再生时间缩短，表明dsSAHH能促进杜氏盐藻鞭毛的再生;　　6、经SAHH抑制剂DZA(25μM)处理后，杜氏盐藻鞭毛不能再生，表明SAHH抑制剂DZA处理能抑制鞭毛再生。　　7、酵母双杂实验筛选出与dsSAHH相互作用的蛋白dsRACK1，并通过pulldown和免疫共沉淀等实验验证了它们相互作用。　　小论:　　通过pH休克的方法我们成功构建了杜氏盐藻鞭毛再生模型，RNA-seq测序筛选出鞭毛再生过程中的差异unigene25，373个，有注释的7，476个。差异基因dsSAHH在杜氏盐藻鞭毛再生过程中表达量上调，它在杜氏盐藻细胞中的过表达能促进鞭毛的再生，而其抑制剂DZA能抑制鞭毛再生。　　第二部分SAHH在食管鳞癌发生发展中的作用　　目的:　　研究SAHH作为新预测的抑癌基因在是食管鳞癌组织和细胞中的表达情况，鉴于前面的实验结果观察人源S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(hSAHH)的过表达对食管鳞癌细胞凋亡、增殖、粘附、迁移能力及细胞周期、细胞形态的影响，初步鉴定SAHH对食管鳞癌的作用是否与纤毛相关。　　方法:　　第一章SAHH在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中的表达差异　　1、分别提取正常食管上皮细胞Het-1A和食管鳞癌细胞EC9706和Eca109的总蛋白和mRNA，Westernblotting和real-timePCR检测hSAHH在各中的表达。　　2、免疫组化检测hSAHH食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达。　　第二章SAHH过表达对食管鳞癌细胞的影响　　1、构建pEGFP-N1-SAHH真核表达载体，转染食管鳞癌细胞株和正常食管上皮细胞;　　2、分别用Westernblotting、细胞S腺苷同型半胱氨酸(SAH或AdoHcy)酶连续循环比色法定量检测试剂盒和同型半胱氨酸(Hcy)检测试剂盒检测SAHH过表达后细胞内SAHH、SAH和Hcy水平;　　3、使用EdU细胞增殖试剂盒，经Apollo(@)和Hoechst33342染色，利用荧光显微镜观察SAHH过表达细胞的增殖;　　4、以TUNEL法和Westernblotting检测SAHH过表达的食管鳞癌细胞株和正常食管上皮细胞的凋亡情况;　　5、细胞经PI染色，用FCM法测定SAHH过表达前后细胞周期分布;　　6、利用Transwell细胞侵袭实验检测SAHH过表达细胞的迁移能力;　　7、扫描电镜观察SAHH的过表达对食管鳞癌细胞纤毛的影响。　　8、Co-IP验证人源SAHH和RACK1的相互作用，Westernblotting检测SAHH过表达后RACK1的变化情况。　　结果:　　第一章SAHH在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中的表达差异　　1、免疫组化和real-timePCR检测结果发现，hSAHH在食管鳞癌组织与癌旁正常组织中都有表达，但是在食管鳞癌组织中表达下调;　　2、与正常食管上皮细胞Het-1A相比，Eca109和EC9706细胞中SAHH在mRNA水平上分别上升28.8％和42.2％(P＜0.05)，而蛋白水平则分别降低13.5％(P＜0.05)和53.6％(P＜0.001);　　第二章hSAHH过表达对食管鳞癌细胞的影响　　1、成功构建EGFP-N1-SAHH真核表达载体，在食管鳞癌细胞株和正常食管上皮Het-1A中的转染率达90％以上;　　2、与转染pEGFP-N1的细胞相比，转染pEGFP-N1-SAHH的Eca109、EC9706和Het-1A细胞内SAHH蛋白表达显著升高(P＜0.05)。与此同时，Eca109、EC9706细胞内SAH浓度显著降低而Hcy浓度显著增加(P＜0.05）;而转染pEGFP-N1-SAHH的Het-1A细胞相对转染pEGFP-N1的细胞SAH和Hcy浓度变化不明显（P＞0.05）;　　3、Westernblotting结果显示，与转染pEGFP-N1的细胞相比，转染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706内凋亡因子caspase-3分别增加～1.6倍和～3.15倍(P＜0.05);TUNEL试验结果发现转染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706的细胞凋亡率分别为6.749±0.045％和9.869±0.078％(P＜0.05)，而转染pEGFP-N1的Eca109和EC9706的细胞凋亡率分别为1.777±0.011％和2.967±0.053％;　　4、EdU实验和流式细胞仪检测结果发现，SAHH的过表达对Eca109和EC9706细胞的增殖及细胞在G0/G1、S和G2/M期的分布的影响不显著(P＞0.05);　　5、Westernblotting检测发现粘附因子E-cadherin在转染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706的细胞中表达量增加而ICAM-1则随着SAHH表达量增加而减少;在Transwell小室实验中转染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706细胞迁移数为124.17±41.32和73.25±13.38而转染pEGFP-N1的Eca109和EC9706的迁移细胞数为205.25±28.19和173.33±38.28(P＜0.05)，表明SAHH的过表达能抑制食管鳞癌细胞的迁移;　　6、扫描电镜观察发现SAHH过表达对食管鳞癌细胞纤毛的影响不明显;　　7、Co-IP证实人源SAHH与RACK1在体内也是相互作用的，并且RACK1在ESCC细胞株中表达量随着SAHH表达量增多而增多（P＜0.05）。　　小论:　　高度保守的hSAHH基因在食管鳞癌组织和细胞中都呈现出表达量下降，本研究中对其在食管鳞癌细胞株Eca109和EC9706中的过表达导致了细胞内SAH浓度下降而Hcy浓度增加，促进了食管鳞癌细胞的凋亡，抑制了其迁移和粘附，但是对其增殖和细胞周期分别没有显著影响。此外，hSAHH蛋白与骨架蛋白hRACK1无论在杜氏盐藻细胞中还是食管鳞癌细胞中都能相互作用。