目的:本研究以卵蛋白为诱导剂建立RA家兔动物模型,经颊针干预后,应用蛋白质组学定量和生物信息学技术分析脑脊液中蛋白质表达水平,从蛋白质组学水平和细胞信号通路探讨颊针在RA中镇痛的分子机制,为促进颊针治疗RA的临床广泛应用提供理论依据。方法:经痛阈筛选健康大耳白家兔40只,随机挑选10只为对照组,其余家兔以卵蛋白诱导建立类风湿性关节炎家兔模型后,随机均分为3组,即模型组、颊针组和体针组;对颊针组和体针组分别施以颊针和体针干预后,采集脑脊液和双后肢膝关节滑膜;经行为学观察、痛阈测定、关节滑膜病理组织学检测、脑脊液蛋白质组学定量技术分析验证、生物信息学技术分析及类风湿关节炎相关差异蛋白的Western blotting验证,观察卵蛋白诱导RA家兔模型动物的行为学变化、痛阈变化和关节滑膜的组织病理学改变,建立脑脊液蛋白质表达谱和筛选差异蛋白,解析差异蛋白质参与的主要生化代谢途径和信号转导途径。结果:通过以上研究,结果表明:1.针刺干预后效应差异分析:经颊针和体针干预后,与模型组相比,家兔精神状态明显好转,饮食量增加,体重缓慢增加,膝关节肿胀缓解,关节活动增强,痛阈逐渐恢复,痛阈差异显著(P<0.05),颊针组与体针组痛阈相比,颊针即时镇痛效应优于体针(P<0.05);影像学显示膝关节周围软组织肿胀缓解,关节间隙狭窄程度和骨质破坏程度有所改善;病理组织学观察,滑膜组织新生血管减少,炎症细胞数量明显减少,滑膜变薄。2.脑脊液中差异蛋白质质谱鉴定:应用i TRAQ技术分析鉴定类风湿关节炎各组家兔脑脊液差异表达蛋白,模型组与正常组家兔脑脊液共筛选出153个差异表达蛋白,其中表达上调78个,下调75个;颊针组与模型组家兔脑脊液共筛选出差异表达蛋白734个,其中表达上调329个,下调405个;体针组与模型组家兔脑脊液共筛选出差异表达蛋白152个,其中表达上调98个,下调54个;颊针组与体针组家兔脑脊液共筛选出差异表达蛋白695个,其中表达上调283个,下调412个。3.生物信息学分析:3.1差异蛋白GO分析:从生物过程、细胞成分、分子功能方面对差异蛋白分析表明,模型组与正常组家兔脑脊液差异蛋白生物过程分为272类,细胞成分分为90类,分子功能分为158类;颊针与模型组家兔差异蛋白生物过程分为1197类,细胞位置分为259类,分子功能分为535类;体针与模型组家兔脑脊液差异蛋白生物过程分为269类,细胞成分分为83类,分子功能分为160类;颊针组与体针组家兔脑脊液差异蛋白生物过程分为332类,细胞成分分为112类,分子功能分为190类。这些差异蛋白质与RA相关的生物过程主要涉及物质转运、能量代谢过程,细胞成分主要涉及细胞质、线粒体、内质网等,分子功能主要涉及有能量代谢、抗原结合、肌动蛋白结合、炎症反应、趋化因子等。由以上分析可知,差异蛋白质涉及种类较多,除了少数功能相对独立的蛋白质外,大多数蛋白质功能的发挥有协同作用或其他作用,与类风湿关节炎病变的复杂性相吻合,提示类风湿关节炎的发生、发展是一个多蛋白参与的复杂过程。3.2差异蛋白KEGG分析:各组家兔脑脊液差异表达蛋白质相关经典通路分析表明,模型组与正常组家兔脑脊液的差异蛋白参与了65条经典通路,颊针组与模型组家兔脑脊液的差异蛋白参与了199条经典通路,体针组与模型组家兔脑脊液的差异蛋白参与了79条经典通路,颊针组与体针组家兔脑脊液的差异蛋白参与了193条经典通路。这些经典通路与RA相关的主要有AMPK信号通路、细胞因子受体通路、Jak-STAT信号通路、趋化因子信号通路等。由此可知,差异蛋白质中涉及RA的信号通路较多,提示RA的发病是多条信号转导通路参与的复杂过程所致,颊针通过调节家兔脑脊液差异蛋白多条信号转导通路的改变发挥其镇痛效应,提示颊针具有多靶点治疗的作用机制。4.差异蛋白验证结果:通过生物信息学分析找出不同组间与类风湿性关节炎相关的部分差异蛋白CD14、TNF-α和CCL3,应用Western blotting进行验证分析。结果表明,与空白组相比,模型组中三者表达量均上调,差异具有统计意义(P<0.05),而在颊针与体针组中,三者表达水平下降,体针组下调较明显。这一结果与蛋白组学分析结果一致。结论:1.颊针疗法能改善RA模型家兔的一般行为学表现、影像学表现、病理形态表现和痛阈,颊针的即时镇痛效应优于体针(P<0.05);2.通过蛋白质组学定量技术与生物信息学分析,提示RA的发病机制可能是多个异常蛋白的表达及多条信号转导通路改变引起。3.颊针疗法通过调节家兔脑脊液中糖酵解途径、磷酸丙糖异构酶及烯醇化酶等在RA的能量代谢过程中发挥着重要作用;4.颊针疗法通过参与家兔脑脊液中炎性相关蛋白质表达的AMPK信号通路、细胞因子受体通路、Jak-STAT信号通路、趋化因子信号通路等多个信号通路来发挥其治疗RA镇痛效应,具有多靶点的作用机制。