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背景及目的星形胶质细胞磷酸化蛋白PEA-15(Phosphoprotein enriched in astrocytes-15k Da)广泛存在于细胞质,位于常染色体Iq21-22,其含有一个DED结构域(death effector domain,DED)---死亡效应区,抑制细胞凋亡。ERK1/2(Extracellular signal-regulated kinases)参与细胞增殖、存活和细胞迁移等多种细胞进程。磁刺激可通过激活ERK通路,促进星形胶质细胞的迁移,并对中枢神经损伤后的炎症反应等起到重要的神经保护作用。PEA-15通过结合ERK1/2阻止其在细胞核中聚集,调控EKR1/2功能,其与磁刺激对星形胶质细胞的迁移作用密切相关。本研究主要是在体外实验中观察磁刺激是否可通过调节PEA-15影响ERK1/2通路,调控星形胶质细胞的迁移作用,并探讨其作用机制。资料与方法1.星形胶质细胞的提取、培养、细胞免疫荧光鉴定:解剖新生1-3天SD(Sprague-Dawley)大鼠获取大脑皮质组织,运用差速贴壁技术分离培养,获取星形胶质细胞,并观察其形态及生长,然后应用免疫荧光技术鉴定GFAP蛋白的表达。2.实验分组:体外划痕试验,根据不同的磁刺激强度将实验分为3组:(1)对照组(不给予磁刺激,但细胞同其他刺激组置于同一环境中);(2)A组(给予30%最大磁刺激强度);(3)B组(给予60%最大磁刺激强度)。3.干扰PEA-15表达后划痕试验实验分组:(1)A组(不给予磁刺激,进行阴形si RNA转染);(2)B组(不给予磁刺激,但对细胞进行PEA-15 si RNA转染,干扰PEA-15表达);(3)C组(给予磁刺激,进行阴性si RNA转染);(4)D组(给予磁刺激,同时进行si RNA转染,干扰PEA-15表达)。观察划痕愈合情况,并运用Western Blot观察PEA-15及其蛋白磷酸化的表达变化。利用荧光测定转染效率;Western Blot半定量测定干扰效果。结果1.从新生1-3天大鼠脑皮质中提取,经差速贴壁分离、培养的星形胶质细胞,细胞免疫荧光鉴定胶质纤维酸性蛋白GFAP表达阳性,DAPI染核测定细胞纯度较高。2.在体外划痕实验中发现,随着磁刺激强度的增加,划痕面积愈合越快,在30%-60%最大磁刺激强度的强度下,星形胶质细胞迁移速度和强度呈正相关,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。3.通过细胞转染荧光提示该转染试剂具有较高的转染效率,对转染细胞进行PEA-15蛋白的测定,Western Blot结果提示si RNA270具有最佳的干扰效果。划痕实验中转染组与磁刺激组均较正常组迁移明显。磁刺激组的P-PEA-15增加明显。结论1.差速贴壁结合摇床方法可培养纯度较高的高星形胶质细胞。2.体外划痕实验中,在磁刺激30%-60%的强度下可明显促进星形胶质细胞的迁移。3.干扰PEA-15的表达后可明显促进星形胶质细胞迁移,磁刺激后可能通过磷酸化PEA-15而促进星形胶质细胞迁移。