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目的通过构建的遗传性高钙尿大鼠模型,探讨骨形成相关因子和1,25(OH)2D3/VDR在肾结石形成中的作用。方法1.18只大鼠被分成2组,10只20代高钙尿大鼠作为实验组,8只体重与高钙尿大鼠相当的SD大鼠作为对照组。大鼠处死后取出肾脏,应用RT-PCR和Western blot分别检测两组大鼠肾组织中BMP2, Runx2, Osterix, MSX2,OPN和ALP在mRNA和蛋白水平的表达。2.45只22代高钙尿大鼠和30只23代高钙尿大鼠被分成三组,每组25只,分别为生理盐水组,VDR干扰组和空病毒组。在实验开始前和开始后的第3、7、14和28天,每组分别处死5只高钙尿大鼠,检测两组大鼠肾组织中BMP2,Runx2, Osterix和OPN在mRNA和蛋白水平的表达；应用Van kossa染色法显示肾组织钙化情况；应用免疫组化法检测OPN的表达。3.取高钙尿大鼠肾脏,分离、培养肾小管上皮细胞。将肾小管上皮细胞分别用生理盐水,VDR慢病毒载体和空病毒载体进行处理,在细胞处理后6,12,24,48和96小时后分别收集细胞,检测处理前后不同时间点BMP2, Runx2和Osterix在mRNA和蛋白水平的表达。同时检测VDR干扰前后细胞钙化的变化。4.在细胞培养基中加入1,25(OH)2D3,共同孵育6,12,24,48和96小时后分别收集细胞,检测孵育前后不同时间点BMP2, Runx2和Osterix在mRNA和蛋白水平的表达。同时检测1,25(OH)2D3处理前后细胞钙化的变化。结果1.骨相关因子在高钙尿大鼠和SD大鼠中的表达：RT-PCR结果显示,BMP2(p<0.01),Runx2(p=0.045),Osterix (p=0.001)和OPN(p<0.01)在高钙尿大鼠肾组织中的表达明显增高。但是两组中MSX2(p=0.088)和ALP(p=0.116)的表达没有统计学意义(p>0.05)。Western blot结果与RT-PCR结果相似。2. VDR对BMP2通路信号相关分子的调控作用：RT-PCR结果显示,VDR干扰组中BMP2, Runx2和Osterix的表达水平在实验开始后的第7,14和28天明显降低,而在生理盐水组和空病毒组中,BMP2, Runx2和Osterix的mRNA表达水平在各个时间点均无明显变化。Western blot结果同样显示,VDR基因沉默降低了高钙尿大鼠肾组织中BMP2, Runx2和Osterix的蛋白表达水平。3. VDR对高钙尿大鼠肾组织中钙磷沉积的调控作用：Van kossa染色结果显示,钙磷沉积于高钙尿大鼠皮质和髓质的肾小管内。VDR基因沉默后,肾小管内的钙磷沉积在实验开始后的第7,14和28天明显降低,但是在空病毒组中,直到处理后的第28天,肾小管内的钙磷沉积依然无明显变化。4.VDR对OPN的调控作用：RT-PCR结果显示,VDR基因沉默后,OPN的表达水平在实验开始后的第7,14和28天明显降低,并且在第14天达到了最低水平。Western blot显示出了与RT-PCR相似的结果。免疫组化结果显示,OPN表达于高钙尿大鼠肾小管上皮细胞的胞质,而且OPN在肾皮质和髓质的表达均较为丰富,但VDR基因沉默后,OPN在肾小管上皮细胞中的表达明显降低。5. VDR基因沉默对肾小管上皮细胞内骨相关因子表达的影响：RT-PCR结果显示,VDR慢病毒载体转染后,BMP2, Runx2和Osterix的表达明显降低(P<0.01),并且随着转染时间的延长,其下降程度越来越明显,Western blot显示出了与RT-PCR相似的结果。6. VDR基因沉默对肾小管上皮细胞钙化的影响：采用Yang Hsueh的方法对细胞钙化进行检测,其结果显示,VDR干扰组中肾小管上皮细胞钙化水平明显降低,而在生理盐水组和空病毒组中,肾小管上皮细胞钙化水平在各个时间点均无明显变化。7.1,25(OH)2D3对肾小管上皮细胞内骨相关因子表达的影响：RT-PCR结果显示,肾小管上皮细胞与1,25(OH)2D3共同孵育12小时后,BMP2, Runx2和Osterix的表达水平开始持续升高,在孵育96小时后,BMP2, Runx2和Osterix的表达水平升高了2倍。Western blot结果显示,肾小管上皮细胞与1,25(OH)2D3共同孵育后,BMP2, Runx2和Osterix的蛋白表达水平明显升高。8.1,25(OH)2D3对肾小管上皮细胞钙化的影响：应用Von Kossa法对肾小管上皮细胞进行染色,其结果显示,1,25(OH)2D3与肾小管上皮细胞共同孵育96h后,VD3组胞质内出现矿物沉积的细胞较多,并且染色更深,对照组仅有少量细胞胞质内出现矿物沉积的现象。同时Yang Hsueh法的结果显示,1,25(OH)2D3与肾小管上皮细胞共同孵育12小时后,细胞内的钙磷沉积开始持续升高,在孵育96小时后,VD3组中BMP2, Runx2和Osterix的表达水平升高了2.14倍。结论1. BMP2, Runx2, Osterix和OPN可能在特发性高钙尿大鼠肾结石的形成过程中发挥重要作用。2.1,25(OH)2D3/VDR可能通过BMP2信号通路及OPN的表达在肾结石形成中发挥重要的调控作用。