民以食为天,食以安为先。近年来,食品安全突发事件频率高是食品安全问题的一个显著特点。其中食品中污染致病菌是引发食源性疾病的主要因素,加强食品检验力度是解决食品安全问题的最有效的途径。国内检测食品中致病菌主要采用传统的培养方法和PCR方法,传统的培养方法操作繁琐,一般需4 d～7 d。PCR检测方法针对某一种或一类病原菌,但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品浪费。多重PCR弥补了普通PCR的缺点,该方法作为一种可同时检测多种致病菌的方法发展十分迅速。本研究建立了单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌及肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR快速检测技术。首先根据单增李斯特氏菌溶血素基因(hlyA)、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)和肠出血性大肠杆菌O157抗原特异基因(rfbE)基因序列,利用Primer5.0设计引物,进行多重PCR反应。将其反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,应用琼脂糖凝胶系统观察结果。并将多重PCR扩增产物进行DNA测序,登陆Genebank将测序结果进行网上blast同源性对比,从而证实三对引物的特异性。本研究选取大量阳性菌株和非阳性干扰菌株进行性特异性验证,结果设计的单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌及肠出血性大肠杆菌引物均能扩增出439 bp、230 bp、151 bp的目的片段,其他菌株均为阴性。还进一步将三种菌株DNA进行随机组合进行多重PCR反应检测其反应的特异性,结果显示均能扩增出特异性目的片段。由此可知,多重PCR检测方法特异性强,可用于同时检测三种致病菌的一种或几种。本研究对多重PCR反应体系进行了优化,试验过程中对镁离子和引物的添加量、dNTPs的添加量、Taq酶的添加量、退火温度和退火时间进行优化。最终确定了多重PCR反应的最佳反应体系和最佳反应条件,该反应体系为:总反应体系50μL。包括5μL 10×PCR buffer,3.5μL Mg2(+25 mM),5.5μL dNTP s,0.6μL(5 U/μL)Taq酶,单增李斯特氏菌10μmol/L上下游引物量均为2μL、金黄色葡萄球菌10μmol/L上下游引物量均为2.2μL、肠出血性大肠10μmol/L上下游引物量均为1.8μL,模板各2μL,灭菌水补足至50μL。最佳反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min—55.4℃45 s—72℃1 min进行33个循环,最后72℃延伸5 min。本研究对三种食源性致病菌纯菌培养物单菌检测灵敏度均为101 CFU /mL;同时检测三种食源性致病菌的灵敏度均为102 CFU /mL。该研究还对人工污染的乳品、肉及肉制品中三种致病菌进行检测,确定其检出限均为103 CFU /mL。对实际样品进行检测,将多重PCR方法与国标进行比较,确定多重PCR方法对三种致病菌(单增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌)的敏感性均为100%、特异性分别为:95.6%、92.3%、92.8%;符合率分别为96.7%、93.3%、96.7%。并且在6 h内可完成检测。结果表明本研究建立的多重PCR检测方法简单快速、特异性强、灵敏度高具有很好的应用前景。