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目的:探讨乳腺癌细胞M2型丙酮酸激酶(PKM2)与表皮生长因子受体表达的相关性;探讨拉帕替尼作为表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂对PKM2表达的影响;探讨拉帕替尼通过抑制PKM2表达对乳腺癌细胞增殖的影响;探讨拉帕替尼通过抑制乳腺癌细胞PKM2表达对转录因子Stat3表达和磷酸化的影响。方法:1.选取了来自天津医科大学肿瘤医院2013-2014年间乳腺肿瘤科82例乳腺癌病人的癌和癌旁组织,通过免疫组化和组织蛋白Western blot分析乳腺癌的癌组织和癌旁组织中PKM2表达情况。并通过乳腺病理资料的分析研究乳腺癌组织PKM2与EGFR和HER2表达的相关性。2.选取MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系,通过Western blot分析乳腺癌细胞系中PKM2表达情况,以及EGFR和HER2表达情况。选取高表达EGFR的乳腺癌细胞系MDA-MB-231,利用si RNA对MDA-MB-231进行EGFR基因沉默,通过Western blot检测EGFR基因沉默对MDA-MB-231乳腺癌细胞系PKM2表达的影响。选取高表达HER2的乳腺癌细胞系SK-BR-3,利用si RNA对SK-BR-3进行HER2基因沉默,通过Western blot检测HER2基因沉默对SK-BR-3乳腺癌细胞系中PKM2表达的影响。3.选取高表达EGFR的MDA-MB-231和高表达HER2的SK-BR-3乳腺癌细胞系。通过Western blot和RT-PCR分析拉帕替尼对PKM2表达的影响。选取MDA-MB-231和SK-BR-3两个乳腺癌细胞系,每个细胞系均分成两组:拉帕替尼处理组和DMSO处理组。对每组细胞进行EGF刺激,通过Western blot检测EGF刺激24h和48h对各组细胞PKM2表达和Tyr-105磷酸化的影响;通过RT-PCR检测EGF刺激24h对各组细胞PKM2表达的影响。选取120例经免疫组化分析HER2(+++)或者经FISH检测提示HER2基因扩增的晚期转移性乳腺癌病人。将120乳腺癌病人分成两组:放化疗加拉帕替尼治疗组和单纯放化疗的对照组。通过ELISA法分析这些病人经拉帕替尼治疗后血清中PKM2水平变化。4.选取MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系,每个细胞系分成三组:拉帕替尼处理组,DMSO处理组,未处理组,用CCK8实验测定每个细胞系中各组细胞的增殖曲线,来观察拉帕替尼对乳腺癌细胞增殖作用的影响。建立PKM2过表达的乳腺癌稳定细胞系,经拉帕替尼处理后通过CCK8实验测定过表达PKM2的乳腺癌细胞系细胞增殖曲线较比对照组有无变化。5.用si RNA对MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系进行PKM2的基因沉默,利用Western blot分析PKM2基因沉默的细胞系中与细胞增殖有关的转录因子Stat3和Tyr-705磷酸化Stat3表达量较比对照组的变化。选取MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系进行了拉帕替尼处理实验。每个细胞系设置三个组:拉帕替尼处理组、DMSO处理组、未处理组。通过Western blot分析拉帕替尼处理组Stat3和Stat3(Tyr(P)-705)的表达量较比对照组的变化。结果:1.乳腺癌免疫组化分析和乳腺癌组织蛋白Western blot测定,以及对乳腺癌病理资料的分析结果表明:PKM2在乳腺癌组织中表达量比正常癌旁组织有显著增加;乳腺癌组织病理资料通过卡方检验进行分析,结果显示在乳腺癌组织中PKM2与HER2之间存在着正向的相关性,PKM2与EGFR之间存在着正向的相关性;利用si RNA对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的EGFR进行基因沉默,结果显示:MDA-MB-231细胞基因沉默后PKM2表达量较比对照组显著降低;利用si RNA对乳腺癌细胞系SK-BR-3的HER2进行基因沉默,结果显示:SK-BR-3细胞基因沉默后PKM2表达量较比对照组显著降低。2.EGF刺激相同时间时,经拉帕替尼处理的细胞系中PKM2的表达量比DMSO处理组显著降低。在拉帕替尼处理组中,EGF刺激对PKM2表达量的影响不大;而在DMSO处理组,EGF刺激后PKM2表达量较比未经EGF刺激组有显著增高。3.通过ELISA法测定病人血清PKM2的水平,结果说明放化疗加拉帕替尼治疗的乳腺癌患者血清中PKM2的水平比单纯放化疗的乳腺癌患者血清PKM2的水平有显著的降低。4.将经拉帕替尼处理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系通过CCK8实验绘制细胞增殖曲线,结果显示经拉帕替尼处理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞较比DMSO处理组和未处理组增殖显著减慢;PKM2过表达的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌稳定细胞系经拉帕替尼处理后,细胞增殖较比阴性对照组和野生型组明显加快。5.经转染PKM2 siRNA的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系中Stat3和pStat3的表达量较比阴性对照组显著降低;经拉帕替尼处理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌细胞系中PKM2的表达量较比对照组有显著的降低;而且经拉帕替尼处理的乳腺癌细胞系Stat3和p Stat3的水平较比对照组也有显著的降低。结论:1.乳腺癌中EGFR与PKM2,HER2与PKM2之间存在着正向的相关性。2.拉帕替尼抑制乳腺癌中PKM2表达。3.拉帕替尼通过影响PKM2表达抑制乳腺癌细胞增殖。4.拉帕替尼通过影响PKM2的表达导致了细胞增殖相关的转录因子Stat3和p Stat3水平的降低从而抑制了细胞增殖。