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Anti-angiogenic agent蛋白(简称AAA蛋白),是从组织纤溶酶原激活剂分子中分离出的一种重组人血管内皮抑素,能够抑制内皮细胞的增殖。该蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,分子量为10kDa左右。
本课题对重组人血管内皮抑素AAA蛋白包涵体的复性纯化工艺进行了研究。探讨了先纯化后复性和先复性后纯化两种工艺方法。结果表明:先复性后纯化方法所得的AAA.蛋白的质量收率和活性收率与先纯化后复性方法相比分别提高了15.6%和18.3%,因此选用先复性后纯化的生产工艺。对AAA蛋白包涵体的柱上复性方法进行研究,选用亲和层析柱复性、离子交换柱复性和凝胶过滤柱复性,结果表明:凝胶过滤柱复性所得到的AAA蛋白的活性收率最高,为194.74%。选用Sephacryl-100 HR凝胶过滤柱复性,并建立变性缓冲液和复性缓冲液的双梯度凝胶过滤柱复性法,研究了尿素梯度、上样蛋白质浓度、复性pH值对复性的影响。复性后的.AAA蛋白电泳纯度达100%,SephadexG-25脱盐后,SP Sepharose FF离子交换进行复性后纯化,获得的AAA蛋白经HPLC检测,纯度达到97.07%,活性回收率达到213.19%,整个工艺得到的AAA蛋白的质量收率为64.44%。
以猪髋动脉内皮细胞(PIEC)为受检细胞,表明AAA蛋白具有抑制内皮细胞增殖的特性,其IC<,50>为1.58μg/mL。