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本研究围绕“番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的免疫抗病机制研究”,通过分离筛选自然弱化菌株、60Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变等不同途径建立青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株库;利用高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)表征无致病力突变菌株的色谱行为,研究不同色谱行为的菌株对番茄青枯病的防治效果,构建“色谱效价指数”(Chromatography titer index,CTI)作为植物疫苗防效评价指标,筛选获得番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458;进一步研究植物疫苗菌株FJAT-1458的营养竞争能力、位点竞争能力及与番茄寄主互作的代谢机制和细胞学行为,主要研究结果如下:1番茄田间青枯雷尔氏菌致病力分化及其与病害发生关系对设施栽培番茄进行青枯病发生调查,在营养生长期和生殖生长期各进行1次,将病害分为5个不同发病级别:0级(健康植株)、1级、2级、3级和4级,统计番茄田间青枯病发病率和病情指数。采集分离不同生育期、不同发病级别的番茄植株不同部位青枯雷尔氏菌,对其进行致病性鉴定,分析番茄青枯雷尔氏菌致病力分化与青枯病害发生的关系。结果表明:共分离到282株青枯雷尔氏菌,经弱化指数和生物测定检测,可分为3种致病力类型——强致病力菌、过渡型菌和无致病力菌。青枯雷尔氏菌在健康和发病番茄植株中均有分布,分布数量为10.5×105-86.7×105cfug-1;健康植株只包含无致病力和过渡型青枯雷尔氏菌,1级和2级植株包含过渡型菌和强致病力菌,3级和4级植株只包含强致病力菌;番茄植株中过渡型菌和强致病力菌的分布总量,在营养生长期高于生殖生长期;同时,营养生长期的植株病情指数(6.12)也大于生殖生长期的病情指数(3.65)。上述结论表明:3种不同致病力青枯雷尔氏菌在番茄植株体内存在竞争现象,其与番茄青枯病的发生密切相关。2番茄青枯病植物疫苗菌株的筛选及其防效评价通过分离筛选自然弱毒株、60Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变,分别获得12、12和40株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌;经致病性检测试验表明,番茄盆栽苗接种15 d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌。利用高效液相色谱对无致病力突变菌株进行表征,64株无致病力突变菌的色谱行为可划分为3种类型(单峰型、双峰型和三峰型),其中单峰型8株,双峰型35株,三峰型21株;构建“色谱效价指数”(Chromatography titer index, CTI),CTI>90%的无致病力突变菌有24株,CTI=100%的有自然弱毒株FJAT-1458、3株60Co辐射突变株和4株EZ-Tn5插入突变株。分析无致病力突变菌的CTI与其对番茄青枯病防效的相互关系,结果表明二者呈极显著相关(P>0.01);利用CTI和防效作为指标筛选获得自然弱毒株FJAT-1458作为植物疫苗菌株,其CTI和防效均达100%。定殖试验表明,FJAT-1458可定殖于番茄植株根系土壤、根部和茎部,定殖数量均表现为“先增后减”的趋势;并且接种浓度越大、苗龄越小,其定殖数量越大。对番茄青枯病的防治效果表明,预接种FJAT-1458的浓度越高,防效越好。FJAT-1458被确定为植物疫苗菌株,用于后续研究。3番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的免疫抗病机制研究营养竞争试验表明:植株疫苗菌株FJAT-1458在碳氮源的利用上略逊于青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91。利用不同碳氮比例的SPA培养基混合培养FJAT-1458与FJAT-91,碳源含量低于20%时FJAT-1458不能生长而FJAT-91可生长;碳源含量大于40%时FJAT-1458可生长,但生长量略低于FJAT-91。氮源含量为0时FJAT-1458和FJAT-91均不能生长,氮源含量高于20%时FJAT-1458的生长量略低于FJAT-91。侵染位点竞争试验表明:先接种植物疫苗菌株FJAT-1458,可在番茄植株体内占领生态位点,阻止后接种的青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91的侵染。先接种FJAT-1458, 3 d后再接种FJAT-91, 15 d后番茄植株发病率为0;同时接种FJAT-1458和FJAT-91, 15 d后番茄植株发病率为24.67%;先接种FJAT-91, 3d后再接种FJAT-1458, 15 d后番茄植株发病率为45%。代谢机制试验表明:将植物疫苗菌株FJAT-1458与青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91按不同顺序接种,均可诱导番茄植株代谢产物种类及含量发生变化,所有处理中相对总含量最高的前10种代谢产物分别是邻苯二甲酸二丁酯(75.83%)、豆固醇(49.30%)、棕榈酸(33.16%)、Myo-Inositol, 1,2,3,4,5,6-hexakis-O-(trimethylsilyl)- (23.2%)、己二酸二(2-乙基己)酯(15.99%)、3,4-二甲基苯甲醛(13.93%)、硬脂酸(12.40%)、Pyrrrol [1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(phenylmethyl)- (11.79%)、2,4-二甲基苯甲醛(11.61%)和吡啶(10.91%)。FJAT-91单独接种处理能诱导番茄代谢产物邻苯二甲酸二丁酯和棕榈酸相对含量逐渐降低至0,而FJAT-1458单独接种或与菌株FJAT-91同时接种及对照处理的番茄植株这两种代谢物维持在相当含量,说明这两种代谢物可能与植株免疫抗病有关。主成分分析表明,不同接种处理诱导番茄植株的代谢谱存在一定的差异,主成分一和主成分二基本上能将其区分开来。细胞超微结构研究表明:利用透射电镜进行观察,植物疫苗菌株FJAT-1458与青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91侵染番茄植株后,均引起番茄组织超微结构的变化。FJAT-1458可侵染番茄植株,但不会对其细胞结构产生明显的破坏作用;而强致病力菌株FJAT-91可侵染番茄植株,并引起植株细胞结构发生一系列的病理变化,包括线粒体囊肿、细胞质膜瓦解、细胞核染色质集聚成团和细胞坏死塌陷,最终导致植株萎蔫死亡。FJAT-91侵入初期未引起寄主细胞产生明显的病理变化,但是从植株发病2级开始,FJAT-91对根部细胞质膜、细胞核和细胞器等结构均产生较强的破坏力。4番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的基因组学研究对植物疫苗菌株FJAT-1458和强致病力菌株FJAT-91的进行Solexa全基因组测序,利用Velvet和ABySS进行de novo拼接,获得707个FJAT-1458框架序列和368个FJAT-91框架序列;菌株FJAT-1458和FJAT-91的基因组规模分别为5.7 Mb和5.6 Mb。通过基因预测FJAT-1458和FJAT-91分别获得7060个和6556个基因,基因密度分别达到86.3%和87.6%。经过rRNA同源比对和tRNA预测,在FJAT-1458中共发现2个rRNA和54个tRNA,在FJAT-91中共发现1个rRNA和48个tRNA。将FJAT-1458同FJAT-91及其他8株已报道的青枯雷尔氏菌致病菌进行比较基因组学分析,发现FJAT-1458特异获得基因有1347个,特异丢失基因有54个。在FJAT-1458中共有549个大于200 bp的基因组岛,共计609540 bp,这些序列在FJAT-91中不存在同源序列,占FJAT-1458重叠群序列总长的11.97%。FJAT-1458和FJAT-91之间的平均氨基酸一致性(AAI)达到99.32%,与GMI1000的AAI均为98.7%,显示了 FJAT-1458与FJAT-91和GMI1000的直系同源基因之间具有极高的相似性。从物种进化树上可见,FJAT-1458和FJAT-91及GMI1000同为进化I型。5番茄青枯病植物疫苗菌剂的研究对植物疫苗菌株FJAT-1458进行培养条件优化和发酵过程适合度研究,确定最佳培养条件为:发酵培养基为SPA培养基、发酵温度为30℃,装液量为35mU250mL。用50 L发酵罐发酵FJAT-1458,发酵过程中菌株数量呈现先升后降的变化趋势;FJAT-1458的生长可分为四个时期:0-12h为发酵适应期、12-36h为对数生长期、36-60h为稳定生长期,72h后为消亡期。研究了植物疫苗胶悬剂的制备工艺,确定胶悬剂制备的适宜参数为:琼脂终浓度为2.0%0、氯化钠的终浓度为2.0%和pH为7.0;在此条件下,胶悬效果最好,质地均匀,无上下分层。比较植物疫苗胶悬剂、生防菌制剂及化学农药对番茄青枯病防治效果,结果表明,植物疫苗胶悬剂能较好地抑制番茄青枯病的发生,其防效(77.45%)与化学农药-农用链霉素(77.23%)相当,配合生防菌“安地”施用,效果更佳,防效达81.81%。