肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成和重塑,肿瘤新生血管已成为崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点。在生理状态下血管生成促进因子和抑制因子之间达到平衡,而肿瘤血管形成的分子机制涉及到两者之间的调节失衡。因此,如果抑制肿瘤新生血管的形成和重塑,肿瘤细胞将发生凋亡或坏死,这为抗肿瘤治疗开辟了新思路。基底膜是细胞外基质,提供上皮和内皮细胞的生长支持结构,它的形成依赖于IV型胶原(Col IV)网络的组装。Col IV由6条不同的α链,即α1-6,并以不同或相同的α链组成三聚体,进一步形成网络为其它大分子提供支架。其中的非胶原区(NC1)经由不同作用机理展示出良好的抗血管活性,以ColIV α3链的NC1在抑制内皮细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡方面效应最强。血管生成抑制剂tumsatin(肿瘤抑素)是ColIVα3的生物活性NC1区的一部分(28 kDa),由ColIVα3链的中间3股螺旋区域C-端12个aa和NC1的232 aa,共244 aa组成。在20世纪80年代,作为肺-肾出血综合症的抗原被发现。2000年,Kamphaus研究表明,其C端185-203 aa具有抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡的直接抗肿瘤作用。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员,为Ⅱ型跨膜蛋白,能选择性诱导肿瘤细胞凋亡,且对正常组织细胞没有明显毒副作用。TRAIL全长由281个氨基酸组成,活性部位为114-281aa片段。我室研制的TRAIL重组蛋白临床试验显示出良好的抗肿瘤活性和低毒副作用。但是,有些肿瘤细胞对TRAIL不敏感甚至耐药,因此,研制和开发活性更强、靶向性更明确的TRAIL类似物对于完全发挥TRAIL的抗肿瘤潜能和克服临床耐药具有重要的实际意义。 本研究将tumstatin183-230和TRAIL的活性片段进行融合,希望得到具有双功能作用的融合蛋白,能够特异性的杀伤肿瘤细胞并抑制新生血管的形成。课题内容包括：①克隆、表达人的tumstatin 183-230和TRAIL活性片段并进行生物学活性研究；②利用SOEing PCR技术扩增tumstatin 183-230-TRAIL和TRAIL-tumstatin183-230的融合编码序列,经克隆表达纯化后,鉴定双功能蛋白及其生物学活性。 一、克隆、表达人的tumstatin183-230和TRAIL片段并进行生物学活性研究 利用PCR技术获得tumstaitn 183-230和TRAIL基因片段,分别构建pMAL-tumstatin183-230和pMAL-TRAIL的重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白得到了有效的表达。在E.coli BL21中的MBP-tumstatin183-230和MBP-TRAIL菌体占总蛋白含量为20％；超声破菌后,融合蛋白主要在上清表达,通过Amylose Resin亲和柱纯化,获得了MBP-tumstatin183-230和MBP-TRAIL蛋白,经Werstern Blot鉴定在48 kDa和62 kDa处得到相应的融合蛋白表达条带。将纯化的MBP-tumstatin183-230和MBP-TRAIL分别作用于内皮细胞ECV304,人胰腺导管上皮癌细胞SW1990,人黑色素细胞瘤A375,和人肝癌细胞HepG2进行活性分析。结果表明:MBP-tumstatin183-230对ECV304,A375,HepG2的增殖抑制呈剂量依赖性。ED50分别为25μg/ml,20.42μg/ml,40.52μg/ml;但对SW1990并不敏感；TRAIL对各细胞的杀伤作用,计算细胞相对活力,结果表明：对SW1990,HepG2,A375均有明显的杀伤作用。ED50分别为20 ng/ml,15 ng/ml,13 ng/ml。但对ECV304则在10μg/ml的浓度范围内,并没有显示很强的杀伤作用。通过管状结构形成实验,MBP-tumstatin183-230可以明显的抑制体外管状结构的形成,因此具有潜在的抗肿瘤活性。 二、融合蛋白tumsatin183-230和TRAIL克隆表达,双功能鉴定及其生物学活性研究 将tumsatin183-230和TRAIL的活性片段融合。希望得到的融合蛋白能够靶向杀伤肿瘤细胞。我们选用原核表达系统制备该融合蛋白。首先,利用重叠PCR技术,合成tumsatin183-23-TRAIL和TRAIL-tumstatin183-230的双向融合基因,tumsatin183-230和TRAIL之间通过氨基酸连接臂相连,将融合基因分别克隆到pMAL-c2载体中,获得重组表达质粒pMAL-tumstatin183-230-TRAIL和pMAL-TRAIL-tumstatin183-230,将其转化至E.coli BL21(DE3)。在IPTG诱导下,SDS-PAGE分析表达量约占菌体总蛋白质的20％左右,主要以可溶的形式表达。经Amylose Resin亲和柱纯化后,得到了纯度在90％以上的MBP-tumstatin183-230-TRAIL和MBP-TRAIL-tumstatin183-230纯化蛋白。再经X因子切割MBP标签后,得到目的蛋白。通过对内皮细胞ECV304细胞增殖抑制试验和人胰腺胆管上皮癌细胞SW1990的杀伤试验,及管腔形成抑制试验,结果表明tumstatin183-230-TRAIL具有良好的双功能活性,即保持tumstatin183-230样活性,又保持了TRAIL样活性；但TRAIL-tumstatin183-230对于ECV304细胞和SW1990几乎没有作用。此外,我们进一步通过流式细胞检测,电镜检测,以及DNAladder检测,证实了tumstatin183-230TRAIL可以诱导SW1990细胞的凋亡。因此,该融合蛋白有望成为抑制肿瘤的新型制剂。