基于位点特异性重组的合成生物学技术开发

来源 :中国科学院大学 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 中国科学院上海生命科学研究院 上海植物生理生态研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ChinaKing1
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噬菌体通过其编码的整合酶识别宿主基因组中的attB位点,与自身的attP位点形成联会复合体从而发生链交换,将噬菌体基因组整合到宿主染色体,由此进入溶源途径;该过程称为位点特异性重组。位点特异性重组具有的多很多优点。我们利用基于链霉菌噬菌体φBT1的整合系统发展了一种体外多片段串联重组拼装的方法(Site-SpecificRecombination based Tandem Assembly method,SSRTA)。并选用抗肿瘤抗生素埃博霉素(epot hil0nes)之生物合成基因簇作为对象。在此基础上,我们将拼接完成的基因簇导入到经遗传改造的天蓝色链霉菌宿主中。通过初步的表达尝试,我们检测到了埃博霉素A的表达。  我们进一步拓展SSRTA的应用,利用该技术快速构建用于链霉菌基因功能研究的基因打靶载体;并结合体外的多片段位点特异性串联重组(φBT1)与体内的位点重组切除筛选标记(φC31),可以对原核生物基因组实现快速多轮的基因敲除或失活。利用该方法,我们连续中断了天蓝色链霉菌内源性抗生素CDA(钙依赖抗生素)和Act(放线菌紫素)的生物合成途径,并敲除了Red(十一烷基灵菌红素)生物合成基因簇转录的负调控因子RrdA的编码基因,最终实现Red的高产。  位点特异性重组分为整合和切离两个可逆的过程,而参与φBT1重组的切离因子尚未被鉴定。通过体内外切离反应和噬菌斑形成实验,我们确定噬菌体编码的Gp3蛋白为φBT1重组系统的切离酶,与整合酶共同作用于底物attL和attR而介导切离反应,生成attB和attP。结合上述的SSRTA方法和目前广泛使用的重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE),链霉菌噬菌体φ盯1的位点特异性重组系统可广泛用于体内外模块元件的拼接、增加、删除和替换;且反应的双向性赋予了该方法可循环重复操作的特性。
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