论文部分内容阅读
Lj-RGD3为七鳃鳗口腔腺中发现的RGD毒素蛋白，含有三个RGD模体序列，且与富含组氨酸糖蛋白(HRG)有一定序列同源性。本课题旨在探讨Lj-RGD3类HRG的抑制血管新生功能和抑菌功能。为了研究其结构与功能的关系，本文对野生型Lj-RGD3进行了RGD及组氨酸His的缺失突变，合成了六种突变体，包括:缺失全部His，并缺失或者保留三个RGD的Lj-26和Lj-27;保留全部His，缺失三个RGD的Lj-112，以及分别只保留第1位，第2位和第3位RGD的Lj-113，Lj-114和Lj-115。将这六种突变基因全序列合成后，构建于载体pET-23b中，IPTG诱导表达可溶性蛋白，然后经组氨酸亲和层析进行纯化。 抗血管新生功能实验方法与结果:用MTT法检测细胞增殖，结果显示，rLj-RGD3的六种突变体蛋白均能在一定程度上抑制碱性成纤维生长因子(bFGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖，并且呈剂量依赖性。用鸡绒毛尿囊膜（CAM）模型研究这七种蛋白的体内抗血管新生功能，结果显示，用等量的蛋白去处理鸡胚，除rLj-26外，rLj-RGD3与其他五种突变体蛋白均能抑制鸡胚的血管新生，其中rLj-112和rLj-27的作用更加明显。抗血管新生分子共同的特点就是它们能够抑制内皮细胞的迁移和浸润。本文用Transwel板检测各蛋白对bFGF诱导的HUVEC细胞迁移和浸润的抑制作用，浸润实验中，在Transwell板中包被人工基底膜基质Matrigel来模仿体内环境。结果显示，除rLj-26外，rLj-RGD3与其他五种突变体蛋白均能抑制HUVEC细胞的迁移和浸润，其中rLj-112和rLj-27的抑制率较高。因此可以得出结论:除rLj-26，野生型rLj-RGD3与其他五种突变体蛋白均具有抑制血管新生功能，且突变体Lj-112和Lj-27都表现出了较野生型和其他突变体蛋白较高的活性。这表明，rLj-112为类HRG蛋白，可能参与生长因子信号通路而抑制血管新生;而rLj-27是RGD毒素蛋白，是以整合素信号通路行使抗血管新生功能的;同时存在RGD模体和类HRG结构并没有使野生型Lj-RGD3的抗血管新生功能得到增强;只含有一个RGD的突变体蛋白Lj-113、Lj-114及Lj-115的抑制血管新生功能均强于野生型rLj-RGD3，说明三个RGD模体间的抗血管新生功能也不是相互叠加的。 抑菌功能实验方法与结果:采用牛津杯法检测rLj-RGD3及其突变体蛋白的抑菌活性，首先选取革兰氏阴性菌大肠杆菌，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和真菌白念珠菌作为试验菌，结果显示，野生型rLj-RGD3与其他突变体蛋白均有一定的抑制真菌活性，但没有抑制细菌活性。相较于其他蛋白，突变体rLj-112的抑菌圈最大，且rLj-112抑制白念珠菌的活性是呈剂量依赖性的。采用逐级稀释法进行活菌计数，来检测rLj-112对白念珠菌最小抑菌浓度(MIC)及抑制率。结果测得野生型rLj-RGD3的MIC值为42μM，rLj-112的MIC值为7.7μM，阳性对照酮康唑(ketoconazole)的MIC值为15μM。接着采用平板菌落计数法测定了rLj-112的杀菌动力学(Time-kill)曲线，结果显示，1×MIC和2×MIC的rLj-112在分别作用12h和6h后，能够使白念珠菌的生长减少98％以上，而0.5×MIC的rLj-112在作用24h后，依然不能明显的抑制白念珠菌。为了观察rLj-RGD3及其突变体处理后白色念珠菌膜的形态，将白念珠菌与各蛋白30℃孵育后，用扫描电镜观察，结果显示，与对照组PBS相比，rLj-112处理过的白念珠菌在形态上发生了明显的变化，白念珠菌细胞膜破裂，且细胞内容物外渗;而缺失掉所有组氨酸的突变体Lj-26抗真菌的活性明显减弱。因此可以得出结论:rLj-112作为类HRG蛋白，能够以独特的机制有效抑制白念珠菌的生长，野生型rLj-RGD3及其他突变体的活性明显弱于rLj-112。而能够有效发挥抑菌功能的最小片段还有待进一步研究。