论文部分内容阅读
间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞。近年来MSCs的另一个特性即免疫调节能力逐渐成为人们关注的热点,MSCs能抑制多种淋巴细胞的功能,在许多免疫相关疾病中被广泛研究,但MSCs的免疫调节机制仍然不是十分明确。组蛋白修饰中的泛素化和去泛素化是表观遗传学中一个重要的领域。MYSM1,一种组蛋白H2A去泛素化酶,能够对小鼠体内的多种免疫细胞发育和功能产生影响。那么,MYSM1是否会调控具有免疫调节能力的MSCs的功能,目前尚未有报道,但这却为MSCs能否在临床中广泛应用提供了 一个新的思路和依据。我们从以下三个部分进行这方面的研究。第一部分:小鼠脂肪来源间充质干细胞的分离、培养与鉴定实验方法:首先利用基因型鉴定方法确定小鼠基因型,然后分离野生型(wild type, WT)小鼠和敲除型(knockout, KO)小鼠的腹股沟脂肪组织来源的MSCs (ADSCs),并对这两种细胞的形态、增殖、表型和成脂成骨分化能力进行鉴定。实验结果:1、Mysm1敲除并不影响ADSCs的形态、表型和增殖。WT和KOADSCs均阳性表达 Sca-1、CD44、CD29,阴性表达 CD86、CD45、CD31、CD11b 及 MHCII 类分子;2、WT和KO ADSCs均具有成脂成骨分化能力。qRT-PCR结果显示成骨相关基因Runx2、Osterix和Ocn以及成脂相关基因Ppar-γ、Cebp-α和aP2的表达量在各自的诱导下均升高。第二部分:MYSM1调控小鼠ADSCs免疫调节功能的体内外研究实验方法:1、qRT-PCR检测Mysm1在炎症环境下的表达变化;2、通过两种ADSCs与T细胞共培养来比较WT ADSCs和KO ADSCs对T细胞增殖的影响;3、在炎症环境下,检测ADSCs表达免疫相关因子的mRNA水平以及细胞表面免疫表型的变化;4、建立IBD模型,检测WT ADSCs和KO ADSCs在体内免疫抑制能力的差别。实验结果:1、Mysm 1在TNFα+IFNγ的刺激下表达最高,并且随着其浓度及时间的增加而升高;2、WT和KO ADSCs均能抑制T细胞增殖,并且WT ADSCs对T细胞增殖的抑制能力要明显强于KO ADSCs;3、无论在有无TNFα+IFNy刺激下,WTADSCs均表达更高的抗炎因子iNOS、IL10,而KOADSCs则表达更高的炎症因子IL1β、TNFα、IFNy及IL6; PD-L1的表达在低浓度刺激下均明显升高且没有差异,ICAM-1和VCAM-1的表达也没有差异;4、体内IBD模型实验也证实了 WT ADSCs具有更强的免疫抑制能力,更有助于小鼠炎症的恢复。第三部分:MYSM1通过miR-150调控小鼠ADSCs免疫调节功能实验方法:1、qRT-PCR检测WT和KO ADSCs中miR-150的表达差异;2、KO ADSCs过表达MYSM1后,检测miR-150的表达变化;3、免疫染色质共沉淀(CHIP)实验验证MYSM1对miR-150的作用;4、C3H10T1/2过表达miR-150(C3H LV- miR-150),检测其表型、增殖能力的变化;5、通过C3H LV- miR-150和C3H LV-GFP (对照细胞)与T细胞共培养实验,比较二者对抑制T细胞增殖能力的差异;6、qRT-PCR和流式技术检测炎症环境下C3H LV- miR-150和C3H LV-GFP免疫相关因子和细胞表面免疫表型的表达差异。实验结果:1、KOADSCs中miR-150的表达明显低于WTADSCs;2、当KOADSCs过表达MYSM1时,miR-150的表达随之升高;3、CHIP显示MYSM1能结合到miR-150启动子上游1200-1000的区域;4、C3H LV- miR-150和C3H LV-GFP的表型没有明显变化,仍然显示出干细胞表型;过表达miR-150相较于对照细胞C3H LV-GFP增殖能力变快;5、C3H10T1/2过表达miR-150后,其抑制T细胞的增殖能力明显增强;6、C3H10T1/2过表达miR-150后,促炎因子IFNγ及信号抑制分子SOCS1表达降低,抑炎因子iNOS和IL10表达升高;7、C3H10T1/2 过表达 miR-150 后,PD-L1、VCAM-1、ICAM-1 表达没有明显差异。结论:MYSM1在ADSCs的免疫调节功能中发挥重要的作用,敲除Mysm1后ADSCs的免疫抑制能力明显减弱。MYSM1能够作用于miR-150的启动子区促进miR-150的表达,从而对ADSCs的免疫调控功能发挥作用,但下游的具体机制还需进一步探究。