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背景与目的大肠癌是世界高发恶性肿瘤之一，居欧美国家恶性肿瘤的第2位。我国上海的调查资料显示大肠癌已升至第4位常见肿瘤，且我国大城市大肠癌发病率正以每年4%的递增速率上升。资料表明，早期大肠癌5年生存率达92%，而进展期大肠癌仅7%，因此提高大肠癌早期诊断率是一项非常有意义课题。发展中的无创或微创大肠癌筛查方法包括粪便隐血试验、粪便生化和免疫学试验、粪便大肠脱落细胞检测、X线钡剂胃肠造影、结肠镜、CT或MR仿真结肠镜、粪便肿瘤标志物检测（包括肿瘤抗原、癌基因、抑癌基因）等。由于大肠癌灶并非都有出血，而肠道出血又未必皆由癌引起，故通过检测粪便隐血筛查大肠癌的假阳性率、假阴性率均较高。结肠镜等检查手段尽管确诊率高，但风险高、花费大，尚难作为一线筛查方法。因此，粪便肿瘤标志物和粪便大肠脱落细胞检测技术将可能成为今后无创性大肠癌筛查的研究方向。提高筛查方法的敏感度、特异度，使之操作更为简便、更宜推广应用的关键技术就是要寻找到与大肠癌密切相关的肿瘤标志物。从异质性细胞悬液中分离目的细胞，最直接方法就是先把目的细胞特异性标记后把它们分离出来。细胞磁选系统是一种敏感、简便、快速、有效的分离细胞方法，主要由磁选柱、磁选架、可与靶细胞结合的抗体、免疫纳米磁珠组成，其中抗体的质量决定了细胞分离的效果。本研究通过差异显示技术确定大肠癌相关蛋白，制备相关抗体，构建了大肠癌细胞磁选分离系统，并对其诊断效率进行了评估。本研究还建立了酶联免疫吸附测定（ELISA）系统，探讨了通过检测可溶性大肠癌相关抗原表达蛋白诊断大肠癌的可行性。此外，在大肠癌发病机理方面，探讨了人乳头瘤病毒与大肠癌发生及病理组织学的相关性。方 法 本课题研究内容分三部分。 第一部分．大肠癌细胞磁选分离系统的构建与应用 1．通过SDS-PAGE电泳分离可溶性大肠癌差异表达蛋白 ①提取大肠癌及自身正常对照组织可溶性蛋白；②SDS-PAGE电泳；③分析癌与对照组织的差异蛋白条带，找出出现率最高的癌上调差异条带,计算分子量；④观察<WP=14>该条带在非大肠癌标本中的出现率；⑤富集该蛋白（soluble colorectal cancer associated protein，MW 47KD, SCAP47），并鉴定纯度。 2．制备相关抗体，测定效价、鉴定特征（1）.制备兔多抗血清 ①实验动物为纯种新西兰白兔；②BCG基础免疫后，分次多点皮下、淋巴结、肌肉注射抗原蛋白乳剂和水剂；③ ELISA和双向凝胶扩散法测血清效价；④分离高效价血清。（2）.制备小鼠单克隆抗体 ①实验动物为BALB/c小鼠；②分次腹腔、脾内注射抗原蛋白乳剂和水剂；③ ELISA测血清效价，无菌技术解剖分离高血清效价小鼠脾脏；④脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合；⑤有限稀释法亚克隆阳性细胞株；⑥克隆细胞种植小鼠腹腔，收获腹水；⑦饱和硫酸铵沉淀法，结合Sephadex G-50脱盐和DEAE-Sephadex A-50层析柱纯化单克隆抗体；⑧鉴定抗体效价、亚类、纯度。 3．大肠癌细胞磁选分离系统的构建与应用 本实验大肠癌细胞磁选分离系统由鼠单克隆抗体、磁选柱、磁场及免疫纳米磁珠（磁标记抗鼠IgG抗体）共同组成。 （1）.实体瘤组织癌细胞筛检试验 ①制备新鲜组织标本单细胞悬液；②细胞与抗体孵育45min：所加小鼠抗体分4组，第1组为抗SCAP47单抗，第2组为抗CEA抗体，第3组为抗CEA抗体和抗SCAP47单抗的混合液，第4组为小鼠多抗血清；③加入Goat-anti-mouse-IgG 免疫磁珠继续孵育45min；④MACS柱置于磁场中，加入上述抗体细胞孵育液，洗柱，柱撤离磁场，洗柱，收集流出液，离心，沉淀加入95%乙醇固定并涂片；⑤细胞HE染色；⑥光镜下观察。（2）.大肠癌脱落细胞磁选试验 ①无菌蒸馏水灌洗结肠并回收；②每份灌洗液底部沉渣液依次经50目、100目、200目、300目筛网过滤，组织消化液消化45min，再经500目筛网过滤；③加入抗SCAP47单克隆抗体孵育45min，再加入Goat-anti-mouse-IgG 免疫磁珠45min；④MACS柱置于磁场中，加入上述抗体细胞孵育液，洗柱，柱撤离磁场，洗柱，收集流出液，离心，沉淀加入95%乙醇固定；⑤细胞HE染色；⑥光学显微镜阅片。 第二部分．ELISA试验检测可溶性蛋白诊断大肠癌<WP=15>①兔多抗血清包被ELISA板；②每孔分别加入大肠癌或其对照组织的可溶性蛋白液，孵育1hr；③加入抗SCAP47单克隆抗体孵育1hr；④加入HRP-Goat-anti-mouse-IgG 孵育1hr；⑤加底物液、显色液、终止液；⑥测450nm下的OD值；⑦分析癌与对照组织OD值分布特点，建立ELISA诊断标准；⑧计算相关统计数据，评价诊断效率。第三部分．多重引物PCR检测HPV DNA①提取组织标本DNA，制备DNA模版；②多重引物PCR扩增DNA，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察；③与标本的病理诊断比较，判断各型HPV DNA与大肠癌相关性。结 果一．大肠癌细胞磁选分离系统的构建与应用 （一）．可溶性大肠癌差异表达蛋白 1．在分子量14KD～66KD间，存在2～5条不等的蛋白差异条带，或表现为癌组织较正常组织高丰度表达，或显示正常组织较癌组织高丰度表达。