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羟基维生素D3可以维持体内钙、磷的动态平衡,调节体内免疫及调控细胞的增殖与分化,在医药、食品和饲料等行业有广泛应用。目前生产羟基维生素D3的方法主要有化学合成与生物催化两种。羟基维生素D3的化学合成法反应步骤多,分离纯化复杂,成本高,环境污染严重,难以适应市场需要。生物催化相比化学合成,具有反应条件温和、反应速率快、反应专一性强、污染物少、能耗低等优点。使用新型绿色溶剂离子液体构成双相体系作为介质生物催化生产羟基维生素D3具有更加优越的前景。本文首先通过富集培养基富集并分离得到了两株具有利用维生素D3作为唯一碳源能力的菌株,经过形态学鉴定初步认定筛得菌株一株是芽孢杆菌(Bacillus sp.)HDZJU1-11,一株是链霉菌(Streptomyces sp.)HDZJU1-12。进一步的摇瓶转化实验证明了这两株菌具有羟化维生素D3的能力。随后,本研究使用离子液体构成双相体系,用筛选得到的芽孢杆菌HDZJU1-11作为生物催化剂催化维生素D3的羟基化反应。通过测定底物在不同离子液体中的溶解度和分配系数,以及分析芽孢杆菌对不同离子液体的生物相容性,选择了 3 种离子液体([BMIm][PF6]、[BMIm][NTf2]和[OMIm][NTf2])分别与缓冲液构成双相体系。实验优化了转化反应的条件,在菌株菌龄为12h,两相体系相比4:1,水相pH为7.5时转化效果最好;而随着底物浓度增大转化率和产率(以质量计算)会有所下降。在最优转化条件下,产物25-羟基维生素D3最高产量为0.38 mg/mL,产率达76.1%。通过基因工程技术,将羟化维生素D3能力的链霉菌HDZJU1-12中的羟化酶P450001、P450002基因全部克隆到大肠杆菌中,对菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-p450001 和 coli BL21(DE3)/pET28a-p450002 进行蛋白诱导表达之后,分别加入一定量维生素D3和7-脱氢胆固醇进行代谢转化,结果证明了 P450001、P450002分别能羟化维生素D3、7-脱氢胆固醇为目的产物25-羟基维生素D3及25-羟基-7-脱氢胆固醇。