淀粉酶在工业用酶领域的地位举足轻重,占据全世界约30％的酶产量。淀粉酶在诸如食品、发酵、纺织、造纸、去垢剂、制药和制糖等众多工业领域有着广泛的用途。耐热耐酸的α-淀粉酶因其在工业生产中的重要作用而引起了研究者的关注。 2002年,Richardson等人从一类嗜热球菌属(Thermococcus sp.)的古细菌中克隆并重组得到了一个α-淀粉酶基因BD5088。这个人工重组酶的最适pH为4.5,最适温度为95℃,是一种耐热耐酸α-淀粉酶,具有潜在的工业应用价值。 BD5088基因全长1308bp,编码的蛋白质含436个氨基酸。该基因已由本实验室合成,并连接上表达载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-BD5088。 本实验的目的是构建α-淀粉酶BD5088的随机点突变文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究。以pET30a-BD5088为模板,设计含随机核苷酸序列的互补引物,分别对BD5088的31.98,124,125,150和240位氨基酸进行定点饱和突变,获得各单点随机突变体库。将该突变体库转化入大肠杆菌BL21进行表达。筛选突变体测定其α-淀粉酶活性。 经过对初步筛选出的15个转化子的DNA测序,在目标位点有13个氨基酸序列发生了突变。对其中7个突变子进行了α-淀粉酶活性检测,2个突变体的酶活低于亲本BD5088,5个突变体的酶活高于BD5088。 本实验成功构建了BD5088的6个位点的随机点突变文库,该库不仅在一级结构上具有良好的随机性和多样性,而且具有生物学活性的多样性,为α-淀粉酶BD5088的定向分子进化和结构与功能的深入研究打下了基础。