前言恶性胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤,其浸润性生长的特点及对放、化疗的不敏感导致临床治疗相当棘手。手术切除配合术后放疗是目前最常用的治疗手段,但疗效差强人意,约70%的恶性胶质瘤在术后1年复发[1-4]。究其原因,肿瘤难以彻底切除,残留瘤细胞对后续放疗的敏感性差是导致恶性胶质瘤复发率高的主要因素。因此,如何提高恶性胶质瘤的放疗敏感性成为攻克这一肿瘤的主要努力方向。肿瘤细胞放射抗性的产生多与下列因素有关：①肿瘤细胞超强的DNA损伤修复能力。部分肿瘤细胞高表达DNA损伤修复相关蛋白,能迅速修复受损DNA,因此对放射治疗产生抗性[5]。②肿瘤细胞较强的抗凋亡能力[15]。恶性肿瘤细胞中某些促存活、抗凋亡通路及分子,如表皮生长因子受体通路,PI3K-Akt通路,p53, Survivin等往往高表达,致使肿瘤细胞抵抗射线诱导的凋亡。最近有文献报道,Notch通路是促进恶性胶质瘤细胞放疗抗性的一条重要信号通路,而其机制正是通过上调胶质瘤细胞内Akt等抗凋亡通路的表达[8]。因此削弱肿瘤细胞的DNA损伤修复能力,促进其凋亡是恶性肿瘤放射增敏的主要策略之一。③肿瘤干细胞的放疗抗性。近年来研究发现,肿瘤干细胞在恶性肿瘤的放射抵抗中发挥不可忽视的作用[13],其机制正与肿瘤干细胞超强的DNA损伤修复能力及抗凋亡能力有关。存活下来的肿瘤干细胞成为肿瘤复发的根源。这一点,我们在实验中也有类似发现。目前对肿瘤细胞放射增敏的研究已进展到分子治疗手段,例如针对放射敏感基因的小分子干扰RNA(siRNA).单克隆抗体[14]等。但这些方法都存在一些问题——基因转移效率低成为制约基因治疗应用的瓶颈；针对单一基因的治疗在体内实验中很难得到令人满意的结果,等等[15]。这些都促使我们寻找一种新的更安全有效,且易于操作的放疗增敏方法,而我们的研究工作发现,γ分泌酶抑制剂(gamma secretase inhibitor, GSI)有望成为一类理想的放射增敏剂。GSI能抑制细胞内γ分泌酶的活性。过去,人们对GSI的研究多集中在阿尔茨海默病的治疗上[16]。近年来人们发现,GSI还具有很强的抗肿瘤效应[17],而这主要是通过抑制Notch信号通路实现的。Notch信号通路已被证实与多种肿瘤的发生进展密切相关,如急性淋巴细胞性白血病[21,21]、卵巢癌[22]、乳腺癌[23]、髓母细胞瘤及恶性胶质瘤等[24,25]。目前已被体外/体内实验证实具有抗肿瘤活性的GSI有多种[26-30],但有关GSI抗恶性胶质瘤的研究还很少,特别是GSI在恶性肿瘤放射增敏中的作用未见报道。因此,我们着手进行该方面研究。目的以人恶性胶质瘤细胞株U87、U251细胞为主要实验对象,通过体内/体外实验,研究Ⅰ型γ分泌酶抑制剂(GSI-Ⅰ)对胶质瘤细胞的细胞毒作用及放射增敏作用,并以CD133+胶质瘤干细胞为切入点,探讨GSI-Ⅰ放射增敏的作用机制,为GSI的抗肿瘤效应提供新证据,为恶性胶质瘤的临床治疗,特别是辅助放疗提供新思路。方法第一部分实验中,我们采用MTT法检测梯度浓度的GSI-Ⅰ对U87、U251细胞生长曲线的抑制作用,利用流式细胞术分析GSI-Ⅰ对U87、U251细胞细胞周期及凋亡的作用,利用免疫印迹法及荧光实时定量RT-PCR等技术研究GSI-Ⅰ对U87、U251细胞中Notch信号通路及其下游一些细胞周期、凋亡相关蛋白表达的影响,初步探讨GSI-Ⅰ细胞毒作用的分子机制。第二部分实验中,我们采用克隆形成实验分析低浓度GSI-Ⅰ对U87、U251细胞放射敏感性的影响；利用磁式细胞分选技术(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)分离U87、U251细胞中的CD133+/CD133-细胞,CD133+细胞培养于无血清的神经干细胞培养基中,CD133-细胞培养于含血清的MEM培养基中。分别研究低浓度GSI-Ⅰ对CD133+/CD133-胶质瘤细胞的放射增敏作用。利用荧光标记的CD133抗体和流式细胞术,分析GSI-Ⅰ对U87、U251细胞及1例原代培养恶性胶质瘤细胞中CD133+细胞比例的影响。采用体外成球实验及台盼蓝染色实验分析GSI-Ⅰ对CD133+/CD133-胶质瘤细胞的毒性作用。最后,利用裸鼠成瘤实验在体内检测GSI-Ⅰ对胶质瘤细胞的成瘤抑制作用及放射增敏作用。结果第一部分实验主要研究GSI-Ⅰ对胶质瘤细胞株U87及U251的细胞毒作用。MTT结果显示,GSI-Ⅰ对U87及U251细胞的生长曲线有抑制作用,且随着浓度与时间的增加而加大。进一步研究表明,GSI-Ⅰ对胶质瘤细胞的毒性作用主要为细胞周期阻滞及诱导凋亡：2.5μmol/L GSI一Ⅰ作用48h后,U87细胞的G1期细胞比例从43.8±1.99%增加至52.96±1.36%(P=0.003),而S期细胞比例从24.81±1.5%减少为9.34±0.53%(P=0.000),G2期细胞比例略有增加；U251细胞则观察到在G1期、S期细胞比例下降的同时,G2期细胞比例大幅增加(从10.43±1.39%到46.97±2.24%,P=0.000)；在诱导凋亡方面,1μmol/L GSI-Ⅰ作用24h或48h,U87细胞的凋亡率较低,分别为2.8±0.48%和2.99±0.55%；U251细胞的凋亡率稍高,分别为3.85±0.52%和9.22±0.25%;2.5μmol/L GSI-Ⅰ作用48h后,U87细胞的凋亡率达到10.29±0.94%,U251细胞的凋亡率则高达22.99±0.94%。为探索GSI-Ⅰ细胞毒作用的可能机制,我们采用RT-PCR、qRT-PCR及Western Blot技术检测GSI-Ⅰ对细胞内Notch信号通路的阻断作用及对一些细胞周期、凋亡相关蛋白的影响。结果显示,Notch-2.Notch-3在U87、U251细胞中表达；GSI-Ⅰ作用12-24小时即可降低Notch靶基因Hes-1的表达,证明GSI-Ⅰ对Notch通路有阻断作用。GSI-Ⅰ作用后两种细胞的抗凋亡蛋白Akt及S6K的磷酸化程度略有降低。U87细胞的Cyclin D1表达下调,U251细胞的CyclinB1表达下调,两种细胞的CDK2都有明显下调。说明GSI-Ⅰ对胶质瘤细胞株的抗凋亡及细胞周期蛋白的活性及表达有影响。这可能是GSI-Ⅰ抗胶质瘤效应的分子机制之一。第二部分实验主要探讨GSI-Ⅰ的放射增敏作用及体内抗肿瘤作用。克隆形成实验显示,低浓度GSI-Ⅰ对U87、U251细胞有显著的放射增敏作用。为探讨放射增敏机制,我们用Western Blot技术检测与DNA修复有关的细胞周期检测点蛋白CHK1、CHK2的表达,发现无影响；检测抗凋亡蛋白Akt的磷酸化水平,发现放射后Akt磷酸化水平增加,在GSI-Ⅰ的作用下则明显降低,提示抑制Akt的活性可能参与GSI-Ⅰ的放射增敏作用。我们还发现,CD133+胶质瘤干细胞的放射抗性要高于CD133-胶质瘤细胞,而GSI-Ⅰ则显著降低CD133+胶质瘤干细胞的放射抗性。流式细胞分析显示,放射后胶质瘤细胞中的CD133+细胞比例大幅增加,而1μmmol/L GSI-Ⅰ作用24小时可显著减少CD133+细胞比例,提示GSI-Ⅰ通过消除CD133+胶质瘤细胞达到放射增敏的效应。体外成球实验显示,GSI-Ⅰ可明显抑制CD133+胶质瘤干细胞的体外成球能力。台盼蓝染色实验显示,1μmmol/L GSI-Ⅰ对CD133+胶质瘤细胞的毒性大于CD133-胶质瘤细胞,而随着GSI-Ⅰ浓度的增加,它对CD133+/CD133-胶质瘤细胞的毒性作用无差异。说明低浓度GSI-Ⅰ可靶向抑制CD133+胶质瘤干细胞。qRT-PCR结果显示,CD133+U87细胞中Notch-2、Notch-3受体及靶基因Hes-1的表达水平明显高于CD133-细胞,提示GSI-Ⅰ的靶向抑制CD133+胶质瘤细胞可能与此有关。裸鼠实验表明,经1μmmol/L GSI-Ⅰ处理的U87细胞,其体内成瘤能力下降,瘤体积比对照组小。对正常U87细胞成瘤的瘤组织,瘤周注射GSI-Ⅰ,可导致瘤组织大片坏死。免疫组化染色结果显示,GSI-Ⅰ能显著降低移植瘤细胞中Hes-1和Nestin的表达,说明Notch信号通路被阻断且肿瘤细胞的“干细胞特性”(Stem-like character)被削弱。结论1、GSI-Ⅰ在体外可抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡,在体内可抑制成瘤并导致瘤组织坏死,具有明确的抗恶性胶质瘤效应。2、低浓度GSI-Ⅰ(1μmol/L)单独作用对恶性胶质瘤细胞的抑制作用有限,但能显著增加胶质瘤细胞的放射敏感性,而这种放射增敏作用是通过靶向抑制放射抗性较强的CD133+胶质瘤细胞实现的。