3个群体刺参遗传多样性分析及AIF-1基因克隆与表达

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:blzzb001
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刺参(Apostichopus japonicus)隶属于棘皮动物门,广泛分布于太平洋西部的中国、俄罗斯、朝鲜、韩国与日本沿海,具有较高的营养和药用价值,是我国重要的养殖种类之一。近年来,由于刺参养殖规模的扩大,个体生长速度缓慢、抗病力能力下降、疾病频发等问题,制约了刺参养殖业的健康发展。因此对刺参遗传多样性、免疫相关基因应答机制进行研究,可为刺参种质改良和疾病预防提供参考依据。本研究利用核糖体内转录间隔区1(ITS1)和线粒体D-loop区序列多态性分析了3个不同地理群体刺参的遗传多样性和遗传结构;同时克隆测序了刺参免疫相关基因同种异体移植炎症因子-1(Allograft inflammatory factor-1, AIF-1)全长cDNA,并分析该基因在刺参不同组织、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)及组织创伤刺激后的表达模式。主要研究结果如下:(1)利用核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列,对中国大连(CD)、朝鲜罗津(KN)和俄罗斯海参崴(RV)3个野生群体刺参的遗传多样性进行分析。经PCR扩增、克隆测序,获得长度为517-519bp、524bp两种类型的ITS1核苷酸序列,平均G+C含量(64.5%)显著高于A+T含量。在刺参30个个体61条序列中共检测49个变异位点,多态位点比例为9.33%,其中4个简约信息位点,共有40种基因型,群体共享基因型为2个。遗传多样性分析表明,3个群体遗传多样性丰富;分子方差分析(AMOVA)显示,88.65%的变异来自于群体内部,群体间遗传分化较弱或中度分化。根据群体间遗传距离进行聚类分析,发现KN群体与RV群体亲缘关系较近,CD群体KN、RV群体亲缘关系较远。(2)刺参CD、KN和RV群体遗传多样性的D-loop分析:对3个群体共计71头刺参的线粒体D-loop序列进行PCR扩增和测序,获得长度为447-465bp的D-loop序列,平均A+T含量(59.2%)显著高于G+C含量;共检测到119个变异位点,多态位点比例为24.24%,其中简约信息位点为53个,共有40种基因型,其中7个基因型被3个群体共享。群体遗传多样性参数分析表明3个群体遗传多样性比较丰富;利用Arlequin3.5分子方差(AMOVA)分析结果表明,3个群体间遗传分化较弱或只有中度分化,群体分化时间为19.68-22.1万年前。CD群体与RV群体之间遗传距离最远为0.042,KN群体与RV群体之间遗传距离最近为0.0374。将本研究所得序列结合GenBank中青岛(QD)和威海(WH)仿刺参的D-loop序列构建系统发育树,QD与WH刺参首先聚为一小支,然后与CD群体聚为一大支,KN群体与RV群体聚为独立一支,这一聚类方式符合地理隔离模式。(3)采用RACE技术克隆了刺参AIF-1基因的全长cDNA序列,该序列全长1541bp,含有一个477bp的开放阅读框,编码158个氨基酸,蛋白计算分子量为17.92kDa,等电点为4.91,另外该基因还具有2个EF-手型钙离子结合基序。采用实时荧光定量PCR方法分析该基因在不同组织、细菌刺激及组织创伤后在体腔细胞中的表达情况。结果显示:健康刺参AIF-1基因在呼吸树、管足、体壁、体腔液、肠和纵肌中都有表达,但在呼吸树中的表达量最高;组织创伤或病原菌刺激均能上调AjAIF-1基因表达,且均在刺激4h后表达量达到最大值,之后表达量逐渐回落,48h后均回落至对照组水平。
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