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抗菌肽是一类具有生物活性的小分子多肽,具有广谱的抗菌活性且不易引起细菌的耐药性,因其独特的抑菌机制,未来可能成为一种新型的抗菌药物。防御素是人体中一类重要的抗菌肽,根据结构可将其分为α和p防御素。人的防御素4(HNP4)是一种由DEFA4基因编码的α类型的防御素,成熟的HNP4由33个氨基酸残基组成,分子量约为3.7 kD。HNP4具有高效的抑菌活性,其抗大肠杆菌的活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的100倍左右,对链球菌和白色念珠菌的抗菌活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的4倍左右,另外HNP4还可以抵抗HIV及HSV等病毒的感染。利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的技术。鸡的输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。但是鸡的生殖系统较特殊,鸡胚的发育在蛋壳内进行,这些特点使得制备转基因鸡较困难。目前利用慢病毒和PGCs制备转基因鸡被认为是最可行的两种方法,但因外源基因的生殖传递效率较低,使得制备转基因鸡的技术仅在少数的发达国家有成功报道。本课题结合输卵管生物反应器的优势,利用慢病毒制备在输卵管中特异表达HNP4的转基因鸡。首先克隆了包含激素依赖性调控元件(SDRE)和负调控元件(NRE)的2.8 kb卵清蛋白启动子(Ova),并在细胞水平上验证了该启动子的生物活性。同时,通过化学合成的方法获得了5’端带有鸡溶菌酶信号肽序列并经过鸡密码子优化的HNP4序列,进而构建了利用ova启动子驱动HNP4基因表达的载体(pWPXL-Ova-HNP4和pWPXL-Ova-HNP4-His),并将其包装成相应的慢病毒。将慢病毒载体注射到自来航鸡胚的胚盘(X期)下腔中以制备转基因鸡,共注射了669个鸡胚,孵化得到了218只小鸡,孵化率为32.6%。将10只G0代生殖嵌合的公鸡与非转基因母鸡交配,在1274只后代中,鉴定得到了15只G1代转基因阳性鸡,生殖传递效率为0.6%～3.4%。Southern blot和Genome Walking结果显示G1代转基因鸡具有6个不同的插入位点,即单拷贝的HNP4分别插入到了鸡的1,2,3,4,6以及24号染色体中。对G1和G2代转基因鸡进行RT-PCR和免疫荧光分析,结果表明HNP4在G1和G2代鸡的输卵管组织中特异表达,而且ELISA检测的结果表明HNP4在G1和G2代转基因杂合体鸡蛋清中的表达量为1.65 μg/mL～10.18 μg/mL,不同插入位点的HNP4基因在转录和翻译水平存在显著差异。综上所述,本论文成功制备了能够在蛋清中表达HNP4的转基因鸡,且外源基因HNP4能够在G1和G2代转基因鸡中稳定表达,这一研究成果为利用输卵管反应器生产药物蛋白奠定良好的基础。