【摘 要】
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高致病性的猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneuminiae,Mhp）是原核生物,它引起的猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是一种慢性高度接触性呼吸道传染病,患病猪养殖效益下降会造成经济损失。孕烷X受体（pregnaneXreceptor,PXR）是一种在机内广泛存在的配体依赖性核受体,不仅在类固醇激素代谢、肠道稳态、胆固醇及胆汁代谢中发
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高致病性的猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneuminiae,Mhp）是原核生物,它引起的猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）是一种慢性高度接触性呼吸道传染病,患病猪养殖效益下降会造成经济损失。孕烷X受体（pregnaneXreceptor,PXR）是一种在机内广泛存在的配体依赖性核受体,不仅在类固醇激素代谢、肠道稳态、胆固醇及胆汁代谢中发挥重要作用,还可以通过调控药物代谢酶及其相关的药物转运蛋白,从而参与机体的药物代谢。CYP3A29是猪体内最重要的细胞色素P450酶,约占猪细胞色素酶总量的30%,代谢猪体内50%以上的外源物质。已有研究发现抗菌肽CecropinB处理过的猪肝细胞系HepLi细胞系中,PXR对CYP3A29具有调控作用。前期通过Mhp动物感染实验我们发现,在Mhp染猪体后,肺部组织中PXR和CYP3A29均显著表达上调。为探究Mhp感染过程中PXR是否对CYP3A29起调控作用,设计开展本实验研究,期望能为Mhp感染炎症反应的调控机制研究提供分子基础和理论依据。目的:构建Mhp细胞感染实验模型,揭示PXR对药物代谢酶CYP3A29基因表达的调控作用,探索PXR在炎症反应中发挥作用的调控机制。方法:通过Mhp对猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar maerophages,PAM）进行感染,建立PAM细胞的炎症模型。对PXR基因进行过表达与干扰,借助RT-qPCR与Western-Blot检测CYP3A29及可能参与其表达调控的上游基因、下游炎症因子的表达,实验用GraphPad Prism、Image J等软件进行数据分析。结果:1.Mhp感染PAM细胞后,通过检测炎症因子IL-6、IL-8的mRNA表达量确定炎症反应程度,发现病原感染24h后IL-6、IL-8的表达量最高且稳定,确定24h为Mhp处理引起PAM细胞发生炎症反应的感染最佳时长。2.通过观察GFP的荧光情况发现,转染36 h后转染效率能达到实验要求,所以选用36h作为转染最佳时长,优化了转染步骤。3.Mhp感染PAM细胞后,PXR、CYP3A29、IL-6和IL-8的mRNA表达水平显著上升。4.在正常PAM细胞中,过表达PXR可提高PXR与CYP3A29基因与蛋白质表达水平;干扰PXR显著降低了PXR与CYP3A29基因表达水平,但降低了 PXR蛋白质表达量对CYP3A29蛋白质表达量无显著影响。Mhp感染PAM细胞后,检测发现PXR的过表达,可显著提高CYP3A29的mRNA水平表达量;抑制表达PXR后,CYP3A29的mRNA水平表达量显著降低;提示Mhp感染后,PXR对CYP3A29表达具有正向调控作用。5.在正常PAM细胞中,过表达PXR可显著提高IL-8的mRNA表达水平,但降低了 TNF-α的表达量,对IL-6的表达量无显著影响;干扰PXR可以显著降低IL-6和IL-8的表达水平对TNF-α的表达量无显著影响。Mhp感染PAM细胞后,发现PXR的过表达,可以显著提高IL-6、IL-8的mRNA表达水平但对TNF-α无显著影响;抑制PXR表达后,显著降低了IL-6、IL-8的mRNA表达水平但对TNF-α无显著影响。提示Mhp感染后,PXR可通过CYP3A29对炎症因子起调控作用。6.在正常PAM细胞中,过表达PXR后NF-kB和RXRα的表达水平显著上调;干扰PPXR后NF-kB、RXRα和TLR2的表达水平显著下调。表明,PXR可能参与调控其他CYP3A29上游基因的表达。结论:1.验证了 PXR是CYP3A29的上游调控基因。2.证明了 PXR在Mhp感染引起的炎症反应中能正向调控CYP3A29基因的表达。3.PXR在Mhp引起的炎症反应中能够通过调控CYP3A29的表达影响相关炎症因子的表达。4.PXR表达水平的变化能影响其他CYP3A29上游基因的表达。
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