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本文旨在探讨携带有11R-P53基因的溶瘤腺病毒是否能够有效的抑制肝癌细胞的生长,同时对我们的基因病毒治疗系统SG7605-11R-P53的靶向性、有效性和安全性作以评价。P53是一个关键的肿瘤抑制因子,对于它的研究已经有30多年的历史,但是目前人们对它还没有一个较全面的认识。它是一个分子量为53kDa的核转录因子,在G1期检查点扮演着重要角色,应答于DNA损伤或致癌基因的激活,从而以确保基因组的完整性。一旦发生DNA损伤或致癌基因激活时,它就会被激活,从而使得细胞周期停滞或诱导其发生凋亡。事实上由于基因突变使得P53很容易失活,从而失去对突变细胞的诱导凋亡作用。在发现的人类肿瘤中有一半以上会发生P53基因的突变,并且其碱基的突变率是非常高的。大量数据表明,突变的P53基因不仅失去了抑制肿瘤的功能,而且也获得了新的促进肿瘤发生的能力。我们实验室前期工作已经证明加入P53基因的溶瘤腺病毒能够更有效地抑制那些P53基因突变的癌细胞的生长。细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides,CPPs)又可称为蛋白转导域(Proteintransduction domain)是一种能携带大分子物质穿过细胞膜进入细胞的短肽。细胞穿膜肽多聚精氨酸11R是一个能够转导生物活性分子进入真核细胞内的短肽,Kazuhito Tomizawa研究小组表明11R-P53融合蛋白能够增强对肿瘤细胞的诱导凋亡率[4-5],从而增强了抗肿瘤的作用。本课题利用穿膜肽11R的特殊穿膜能力,以期增强携带有P53基因的溶瘤腺病毒的再次感染肿瘤细胞的机会,以达到彻底杀灭肿瘤的目的。
本研究利用本实验室构建的携带有细胞穿膜肽11R的溶瘤腺病毒SG7605-11R-P53以及对照病毒SG7605-P53分别感染肝癌细胞株HepGⅡ、SMMC-7721、Hep3B、Huh7和成纤维细胞株BJ,用western blot方法检测目的蛋白P53的表达情况,结果显示SG7605-11R-P53和SG7605-P53均能在肝癌细胞株中和正常细胞内正常表达。而增殖实验表明,SG7605-11R-P53能在肝癌细胞HepGⅡ、SMMC-7721、Hep3B、Huh7中大量增殖,而在正常肝细胞LO2内和成纤维细胞株BJ内复制能力较弱,而且SG7605-11R-P53的增殖倍数要高于SG7605-P53的;同样,MTT实验结果显示SG7605-11R-P53对肝癌细胞株HepGⅡ、SMMC-7721、Hep3B、Huh7有较强的杀伤效果,而对正常成纤维细胞株BJ的杀伤力较弱,并且SG7605-11R-P53具有更强的杀伤效果。分别将携带细胞穿膜肽11R的溶瘤腺病毒SG7605-11R-EGFP以及不含细胞穿膜肽11R的溶瘤腺病毒SG7605-EGFP感染肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B、Huh7和正常肝细胞LO2,荧光显微镜下观察并拍照发现,在肝癌细胞HepGⅡ、Hep3B、Huh7中SG7605-11R-EGFP的荧光在亮度和密度上都强于相同MOI条件下的SG7605-EGFP的作用效果,同时我们也观察了不同时间点SG7605-11R-EGFP在肝癌细胞内和正常细胞内的荧光变化情况,结果显示,随着时间的增加,肝癌细胞株HepGⅡ、Hep3B中的荧光亮度和密度是逐渐增强的,而在正常细胞中,荧光亮度和密度是几乎不变的。将SG7605-11R-EGFP、SG7605-EGFP以及带有标记的自由肽11R与SG7605-EGFP的组合分别感染肝癌细胞,我们发现相同条件下SG7605-11R-EGFP的感染效率最高,其次分别是SG7605-EGFP+11R和SG7605-EGFP。在BALB/c裸鼠皮下制备肝癌Huh7的肿瘤模型,在肿瘤生长至7～9mm时进行随机分3组治疗,分别进行瘤内注射SG7605-11R-P53和SG7605-P53以及对照组的PBS,自第一次治疗开始,定期测量肿瘤体积。结果显示经过SG7605-11R-P53和SG7605-P53治疗的裸鼠的肿瘤体积明显的小于空白对照组,并且SG7605-11R-P53对肿瘤生长的抑制率明显的高于SG7605-P53的。由上述可知,我们的携带细胞穿膜肽11R的溶瘤腺病毒SG7605-11R-P53能在肝癌细胞中大量增殖,并对肝癌细胞具有高效的杀伤效果,而对正常细胞具有较弱的侵染能力和杀伤力,充分表明了SG7605-11R-P53是一种安全并且有效的溶瘤腺病毒。通过本课题的研究,我们联合细胞穿膜肽11R的特殊穿膜能力和P53基因对肿瘤的诱导凋亡的能力以及对溶瘤腺病毒的靶向性调控,用于对肿瘤有效地治疗,进一步完善了我们基因-病毒治疗系统,为以溶瘤腺病毒载体系统为主的靶向治疗癌症建立了基础。