犬流感(canine influenza,CI)是由犬流感病毒引起的以犬体温升高、咳嗽、流鼻液、打喷嚏、食欲减退、精神沉郁、呼吸困难为典型临床症状的呼吸道传染病。由于犬作为伴侣动物在现代人们生活中的特殊地位,犬感染流感病毒不仅对养犬业的发展不利,而且对人类健康造成威胁。根据文献报道,H3N2亚型流感病毒对犬是低致病性的,部分犬感染后临床症状不明显或呈隐性感染,并且患犬的排毒期只有7天,所以应用病原学检测方法无法准确地进行犬流感的诊断。然而,犬感染流感病毒后体内会长期存在犬流感病毒的抗体,根据这一原理本研究建立了一种针对抗体的血清学检测方法。　　 本研究利用特异性引物扩增犬流感病毒H3分离株的HA1基因,将其连接到pMD18-T载体后进行序列测定。将测序正确的克隆质粒酶切后回收HA1基因,将其亚克隆到表达载体pEI-32a(+)中,构建了pET-HA1重组表达质粒,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE可见在相对分子量58ku左右处出现新的蛋白条带,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导时间为5h时,表达量最高。Western-Blot分析可见,表达的融合蛋白可与CIV阳性血清发生特异性反应,证明表达产物抗原性良好。将诱导后的菌体进行超声破碎,SDS-PAGE可见该融合蛋白全部以包涵体形式存在,大量表达后,经亲和层析法纯化后获得了纯度较高的HA1蛋白。　　 以纯化的重组HA1蛋白作为检测抗原,建立了检测H3亚型CIV抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA方法各组分的最适反应条件为:HA1抗原浓度为8μg/mL,血清稀释倍数为60倍,二抗稀释浓度8000倍,抗原和血清、血清和二抗都是在37℃条件下反应45分钟,底物作用时间为30分钟,阴阳性临界值为0.228。初步建立的间接ELISA检测方法,通过交叉试验、重复性试验验证,表明该方法特异性强、重复性好。与HI作对比实验,同时对临床采集的血清进行检测,检测结果表明建立的ELISA方法的敏感性较高,并且两者的符合率达到95％以上,建立的间接ELISA方法为H3亚型犬流感病毒抗体检测提供了一种快速、准确、简便的方法。