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整合的外源基因以低拷贝数时能较稳定的遗传表达;然而,无论是花粉管通道注射和基因枪轰击,还是根癌农杆菌介导的棉花遗传转化体,都普遍存在整合有3个以上转基因拷贝的转化体。因此,无论是基于育种应用的角度,还是研究转基因整合特征,分析转基因植物外源基因的拷贝数均为基础步骤。本文首次采用基因表达定量分析的PfaffI法应用于外源基因拷贝数的研究,并利用该方法对三种方法转化棉花的外源基因拷贝数做了比较研究。外源基因的整合是随机分布在染色体的不同区域里。我们认为,外源基因在受体基因组整合的随机分布这一特征并不能被认为受体基因组中T-DNA整合位点碱基序列或结构上的任意性。对整合到受体基因组T-DNA,往往伴随有T-DNA自身或受体基因组DNA的重复、缺失及倒置等现象,但有关文献多集中在模式植物中。因此,本文主要对根癌农杆菌介导的棉花转化体T0代单株的T-DNA整合特征做了较为深入的研究。全文研究结论如下:1) PfaffI法在分析转基因棉花中整合T-DNA拷贝数的应用:本文首次采用分析基因表达研究用的实时定量PCR中的PfaffI法分析转基因棉花中整合外源基因拷贝数。与Southern Blot杂交结果比较表明,该法的分析结果等于或高于后者。考虑到Southern Blot法研究转基因拷贝数最重要缺陷,相比较而言,PfaffI法能够更加真实地鉴定出外源基因的拷贝数。2)三种转化方法转化棉花中整合T-DNA拷贝数的差异:根癌农杆菌介导、基因枪轰击和花粉管通道注射转基因当代群体中外源基因拷贝为1-2的植株比例分别是26.2%,60%和42.8%。且根癌农杆菌介导的转基因群体中,高达27.3%的株系整合的外源基因在5拷贝以上,而基因枪轰击和花粉管通道注射法转基因群体中则没有5拷贝以上转基因植株。3)转基因棉花中载体骨架的整合和T-DNA的缺失及剪辑位点的碱基组成:在转基因棉花中, T-DNA左、右臂均有存在载体骨架序列的整合和T-DNA边界及边界内侧的缺失等现象。T-DNA左臂剪辑位点为A或T的比例占89.5%;而右臂剪辑位点为G的比例分别占87%。4) T-DNA在转基因棉花基因组的分布:T-DNA在棉花基因组中的整合位点可以分为蛋白编码区序列、质粒来源DNA序列、微卫星序列、转座子和拟转座子序列、35S启动子序列及未知序列等六大类。T-DNA在棉花基因组中的整合位点没有明显的染色体区域偏爱性,但棉花基因组中与T-DNA的右臂附近区域序列“同源”的基因组序列很可能是T-DNA整合的热点序列。