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目的：肺癌是人类最常见的恶性肿瘤，其中80%~85%为非小细胞肺癌（non-small celllung cancer，NSCLC）。治疗NSCLC最常用手段是手术切除辅以放化疗。然而，传统化疗药物多为DNA合成抑制剂，副作用大，特异性差，临床应用受到极大限制。近年来，以吉非替尼（gefitinib）为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）在NSCLC临床治疗中疗效显著。研究表明，对TKI敏感的NSCLC多为腺癌，主要发生于亚裔、女性、非吸烟患者，且肿瘤细胞多携带EGFR的18、19或21外显子突变。然而，随着该类药物的临床应用时间推移，人们发现许多原本对TKI治疗敏感的NSCLC患者在接受治疗一段时间后会产生获得性耐药。克服TKI获得性耐药已成为临床亟待解决的问题。文献报道的NSCLC患者TKI获得性耐药发生机制主要有：EGFR20外显子的T790M突变，KRAS等EGFR通路下游编码基因突变，EGFR旁路的其他基因如MET异常扩增及癌细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）等。这些耐药机制多涉及DNA改变，例如EGFR的T790M突变已被认为是TKI获得性耐药发生的较明确的原因。放射线治疗肿瘤的机制是通过损伤细胞DNA抑制和杀死肿瘤细胞。可否通过改变肿瘤细胞DNA，逆转TKI耐药值得探讨。本实验选用人NSCLC细胞系NCI-H1975（携带EGFR21外显子L858R突变和20外显子T790M突变）作为亲本株，用X线照射自建的吉非替尼获得性耐药细胞系NCI-H1975/GR，建成X线放射细胞系NCI-H1975/GR/XR。通过比较三株细胞对吉非替尼的敏感状态，探讨X线照射体外逆转NSCLC细胞系NCI-H1975吉非替尼获得性耐药的可能性，并初步探索其机制，希望为吉非替尼更有效地用于NSCLC个体化治疗提供一些帮助。方法：1.细胞系的建立1.1HRMA法明确细胞系NCI-H1975的EGFR、KRAS和BRAF基因突变状态；1.2逐步增加药物浓度、体外间歇作用法诱导NCI-H1975细胞发生吉非替尼获得性耐药，历时1年建成吉非替尼获得性耐药细胞系，命名为NCI-H1975/GR；1.3用X线照射NCI-H1975/GR细胞，照射剂量6Gy/次，待细胞恢复稳定生长，消化传代后复用相同剂量的X线照射，共4次，建成X线照射细胞系，命名为NCI-H1975/GR/XR。2.检测三株细胞生长及对吉非替尼的耐药状况台盼蓝拒染法分别计数不同浓度吉非替尼作用后三株细胞的活细胞数，描绘吉非替尼对其生长抑制曲线；MTT法检测三株细胞的吉非替尼IC50值和耐药指数；倒置显微镜下直接观察三株细胞的形态及生长状况；细胞计数法描绘三株细胞的生长曲线并计算群体倍增时间；流式细胞仪分别检测三株细胞吉非替尼加药前后的细胞周期分布变化及凋亡细胞比例变化。3. Western-Blot法检测三株细胞中E-cadherin和vimentin蛋白的表达，了解EMT变化状态。4. HRMA法检测NCI-H1975/GR/XR和NCI-H1975/GR细胞的EGFR、KRAS和BRAF基因突变状态。结果：1. HRMA法检测结果显示：NCI-H1975细胞存在EGFR21外显子L858R突变和20外显子T790M突变。2.三株细胞生长及对吉非替尼的耐药状况2.1台盼蓝拒染法结果显示：吉非替尼作用24h后，NCI-1975/GR/XR的活细胞数目与NCI-H1975/GR相比无显著差别（P>0.05），但第二天开始，NCI-H1975/GR/XR的活细胞数显著降低（P<0.05）。在同一作用时间内，NCI-H1975/GR/XR的活细胞数与吉非替尼作用浓度呈剂量依赖负相关；2.2MTT法检测三株细胞NCI-H1975/GR/XR、NCI-H1975/GR和NCI-H1975的IC50值分别为6.40±0.17μmol/L，12.42±0.09μmol/L和6.15±0.22μmol/L；NCI-H1975/GR对吉非替尼的耐药指数是2.02，而X线照射后细胞对吉非替尼的耐药指数降低为1.04；2.3三株细胞在形态上存在差异，耐药细胞NCI-H1975/GR由亲本细胞NCI-H1975的长梭形变为纺锤形，且体积变小；X线照射后NCI-H1975/GR/XR部分细胞变回长梭形；2.4NCI-H1975/GR/XR、NCI-H1975/GR和NCI-H1975群体倍增时间分别为46.68±2.68h、47.73±3.50h和38.70±5.92h；NCI-H1975/GR/XR倍增时间较NCI-H1975/GR缩短了1.05h（P>0.05）；2.5与作用前比较，吉非替尼作用后三株细胞的G0/G1期细胞比例均有增加（P<0.05）；与NCI-H1975/GR相比，NCI-H1975/GR/XR的G0/G1期细胞比例增加幅度更为明显（P<0.05）；2.6与NCI-H1975/GR相比，20、40μmol/L低浓度吉非替尼作用后，NCI-H1975/GR/XR的凋亡细胞所占比例无显著差别（P>0.05）；但80μmol/L高浓度吉非替尼作用后，NCI-H1975/GR/XR的凋亡细胞所占比例明显升高（P<0.05）。3. Western-blot结果显示：与NCI-H1975相比，NCI-H1975/GR细胞的E-cadherin蛋白表达减弱，vimentin蛋白表达增强；与NCI-H1975/GR相比，NCI-H1975/GR/XR细胞的E-cadherin蛋白表达增强，vimentin蛋白表达减弱。4. HRMA法结果显示：与NCI-H1975相比， NCI-H1975/GR/XR与NCI-H1975/GR细胞均未发现新的突变。结论：1. X线照射可以体外逆转NSCLC细胞系NCI-H1975的吉非替尼获得性耐药。2. X线照射逆转吉非替尼获得性耐药的机制可能与“间质-上皮转化”有关。