研究目的: 近年来，肺癌死亡率居于各种恶性肿瘤之首位，其中肺腺癌最常见并且其发病率最高。由于肿瘤发生和生长的主要原因在于细胞凋亡受到抑制，因此，诱导肺腺癌细胞凋亡是治疗肺腺癌的重要措施，也是降低肺癌死亡率的有力手段之一。本文以人肺腺癌A549细胞系为例，利用化学遗传学这一新兴技术平台，筛选有效的诱导肺腺癌细胞凋亡的小分子化合物并研究其凋亡诱导分子机制，为进一步研究小分子凋亡诱导剂的特异性靶蛋白这一后续工作奠定基础，同时为开发新型的肺腺癌治疗药物提供理论依据。 研究内容: 1．对小分子化合物进行初步筛选 2．鉴定小分子化合物对A549细胞的凋亡诱导作用 3．研究小分子化合物诱导A549细胞凋亡的分子机制 研究方法: 1．MTT法检测细胞存活率，由此对小分子化合物进行初步筛选 2．倒置相差显微镜观察细胞形态变化 3．LDH(乳酸脱氢酶)检测细胞是否出现坏死 4．吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察，检测细胞核凝集 5．TUNEL染色检测DNA片段化和凋亡率 6．荧光探针DCHF检测ROS表达水平 7．利用TMRM染色检测细胞线粒体膜电位变化[Falchietal，2005] 8．免疫荧光化学法检测膜整连蛋白β4的表达 研究结果: 1. 苯并噁嗪酮衍生物对A549细胞的生长抑制作用 1.1 MTT检测结果表明，在24h-48h内，5种苯并噁嗪酮衍生物(1-5＃)均能抑制A549细胞的生长，且其抑制作用呈现时间和浓度依赖性。 1.2 倒置相差显微镜观察细胞形态发现：200μM苯并噁嗪酮衍生物(1-5＃)分别处理A549细胞24h，细胞明显缩小，有的细胞变圆。 2. 二茂铁基吡唑并哌嗪化合物对A549细胞的凋亡诱导作用 2.1 MTT检测结果表明，在24h-48h内，6种二茂铁基吡唑并哌嗪化合物(8a-8f)均能显著降低A549细胞的存活率并且其作用效果呈现时间和浓度依赖性。 2.2 倒置相差显微镜观察细胞形态发现：8d-8f各20μM分别处理A549细胞24h-48 h，细胞呈现典型的凋亡形态学特征。 2.3 吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜检测细胞核片段化，发现：20μM8d-8f分别处理A549细胞48h时，细胞核固缩、染色质凝集、凋亡小体清晰可见。 2.4 LDH检测发现：8d-8f各20μM分别处理A549细胞48h时，与对照组细胞相比，培养液中LDH酶活浓度未发生显著性变化(P>0.05)。 2.5 TUNEL染色发现，8d-8f各20μM分别处理A549细胞48h，TUNEL染色阳性率显著升高(P<0.01)。 2.6 使用荧光探针DCHF检测细胞内ROS水平的变化，结果发现，8d-8f各20μM分别处理A549细胞48h时，细胞内的ROS水平显著升高(p<0.01)。 2.7 利用TMRM染色检测细胞线粒体膜电位的变化，结果显示，8d-8f各20μM分别处理A549细胞48h时，细胞内的线粒体膜电位显著升高(P<0.01)。 2.8 免疫细胞化学检测发现，8d-8f各20μM分别处理A549细胞48h时，膜整连蛋白β4的水平显著升高(p<0.01)。 结论: 1．小分子化合物初步筛选结果表明，5种苯并噁嗪酮衍生物对A549细胞生长均有抑制作用，其中2＃、3＃和5＃化合物的抑制作用比较明显。 2．MTT初步筛选结果显示，6种二茂铁基吡唑并哌嗪化合物(8a-8f)对A549细胞增殖均有抑制作用，但其增殖抑制能力不同，其中8d、8e、8f三种小分子化合物增殖抑制能力较强，因此选取该三种小分子继续研究其对A549细胞的作用及其分子机制。 3．8d、8e、8f三种小分子化合物20μM均能诱导A549细胞凋亡，而该凋亡诱导作用可能是通过提高ROS水平和影响线粒体膜电位来实现的。 4．在8d、8e、8f三种小分子化合物诱导A549细胞凋亡的过程中，膜整连蛋白β4的表达水平升高，说明膜整连蛋白β4可能是该类小分子化合物诱导A549细胞凋亡途径中的一个重要因子。