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自然杀伤(Naturalkiller,NK)细胞在机体抗肿瘤、抗病原微生物感染、妊娠和免疫调节等过程中发挥重要作用。随着免疫治疗的兴起,NK细胞也逐渐用于治疗肿瘤、自身免疫病甚至生殖相关疾病。然而,由于对NK细胞发育分化的了解有限,NK细胞体外扩增仍然困难。成年小鼠NK细胞由造血干细胞(haematopoietic stem cells,HSC)发育而来,经历共同淋巴细胞前体(common lymphoid progenitors,CLP)、pre-NK前体细胞、rNK前体细胞、未成熟NK细胞、成熟NK细胞各个阶段。从CLP向pre-NK前体细胞发育是决定NK细胞谱系形成的关键阶段。转录因子NFIL3决定了 CLP向NK细胞前体的发育,是调控NK细胞早期发育的关键因子。已有文献报道NFIL3通过调节转录因子TOX、EOMES、ID2的表达来促进NK细胞的发育。但目前还没有文献报道什么分子能直接上调NFIL3。PBX1是一个在胚胎发育过程中发挥诸多作用的转录因子。造血系统特异性缺失PBX1的小鼠HSC稳态被打破,更多地处于细胞分裂状态,自我更新能力受损,其CLP细胞、B细胞、NK细胞明显减少,但T细胞正常。T细胞与NK细胞都由CLP分化而来。因此,除了 PBX1缺陷会影响HSC自我更新之外,应当存在其他原因导致CLP向NK细胞发育受损。并且在NK细胞发育过程中PBX1的作用靶标也是未知的。因此我们关注NK细胞核心转录因子NFIL3的上游转录调控机制,研究转录因子PBX1是否可以直接调控NFIL3表达及其分子机制,获得了如下结果:1.缺失PBX1时NK细胞早期发育受损为探究PBX1在NK细胞发育过程中的作用,我们构建了造血系统特异性缺失PBX1的小鼠。通过流式细胞术检测发现,缺失PBX1的小鼠骨髓NK细胞前体(pre-NKP和rNKP)和小鼠NK细胞比例和数目均下降,而T细胞不变。因此PBX1可能作用于CLP向NK细胞前体发育的阶段。2.缺失PBX1时NK细胞表达NFIL3水平下降缺失PBX1导致NK细胞前体减少,这与缺失NFIL3的小鼠现象一致。为探究PBX1是否影响NFIL3表达水平,我们使用流式内标技术检测了 PBX1条件性敲除小鼠,发现缺失PBX1的骨髓和脾脏NK细胞内NFIL3及其下游分子EOMES的表达量明显下降。因此PBX1能影响NFIL3的表达。3.PBX1可以直接结合Nfil3启动子为探究PBX1是否通过直接结合Nfil3启动子发挥作用,我们通过生物信息学预测,发现Nfil3启动子区含有潜在的PBX1结合位点。通过小鼠骨髓NK细胞ChIP实验证明NK细胞中PBX1结合了Nfil3启动子上预测结合位点所在区域。通过萤光素酶报告实验和DNA-pulldown实验我们也证明了在体外PBX1能结合并活化Nf113启动子。4.NFIL3启动子区PBX1结合位点缺陷的小鼠NK细胞早期发育受损PBX1缺失会导致CLP减少,这与NFIL3缺失不一致,这一差异是由于PBX1影响造血干细胞稳态。为了排除PBX1对造血干细胞的影响,我们用CRISPR-Cas9技术敲除小鼠基因组Nfil3启动子中PBX1结合位点,流式细胞术检测发现该小鼠骨髓CLP细胞比例不变而pre-NKP和rNKP细胞比例下降,NK细胞比例下降,而T细胞、B细胞比例不变。因此当PBX1不再调控Nfil3启动子后,从CLP向NK细胞谱系形成发育受损。表明PBX1确实通过结合Nfil3启动子调控NK细胞早期发育。5.PBX1结合Nfil3启动子依赖于PBX1第286位氨基酸为了检测PBX1蛋白上哪些氨基酸介导与Nfil3启动子的结合,我们对PBX1进行分区截短以及单个氨基酸替换突变,进行萤光素酶报告实验和DNA-pulldown实验,发现PBX1第286位氨基酸天冬酰胺对与Nfil3启动子的结合起关键作用。综上所述,我们证明了转录因子PBX1可以通过其homeodoiman中第286位天冬酰胺结合Nfil3启动子促进NFIL3转录,从而促进NK细胞的早期发育。该课题完善了对PBX1的相关研究,并有助于了解NK细胞的发育。这也为NK细胞体外扩增用于细胞免疫治疗奠定了理论基础。该研究的创新之处在于:(1)我们首次报道NK细胞发育过程中NFIL3上游直接调控NFIL3表达的转录因子;(2)我们完善PBX1对NK细胞发育的影响机制,PBX1调控NFIL3表达从而影响CLP向pre-NKP细胞发育;(3)我们找到PBX1蛋白中影响其结合Nfil3启动子能力的单个氨基酸Asp286。