电化学生物传感器具有简单、成本低、灵敏度高等优势,被广泛应于临床诊断、环境监测、食品分析和病原微生物研究等领域。在电化学生物传感器研究构建时,利用多功能的纳米材料和高效的信号放大策略改善电化学生物传感器的各项性能,这些新方法和新技术的研发,对各种生物分子特异、灵敏的检测具有十分重要的科学意义和使用价值。本论文设计多种引入信标物质的方法,结合多种信号放大策略和多功能化纳米材料,分别制备了高通量、高灵敏、操作简便及生物相容性好的几种电化学生物传感器。具体的工作如下:1.结合多标记多组分检测策略和设计新的阵列电极构建高通量电化学免疫传感器的研究多标记策略可以实现传感器同一界面的多组分同时测定,但是这种方法受到了标记电活性物质数量的限制,从而限制了传感器的检测通量。为了提高传感器的检测通量,本研究将多标记多组分检测策略与阵列电极多组分检测方法相结合,构建了高通量电化学免疫传感器,达到同时对肝癌六种标志物的检测。在本研究中,新设计的阵列电极由三个检测点和一个对照检测点组成。首先,在每一个检测点上同时固载两种不同抗原的一抗,所对应的二抗分别标记了两种具有不同氧化还原电位的电活性物质。在夹心免疫反应作用下,可以通过两种电活性物质电流峰位置的不同和峰值大小对两种抗原的浓度进行定量。由此,在一个电极上,三个分析检测点可以同时完成六种生物标志物的检测,与此同时,对照检测点可以完成空白对照的测定。另外,为了提高了传感器检测的灵敏度,合成了Pt Pd双金属/石墨烯纳米片（Pt Pd-GS）用来固载二抗和辣根过氧化物酶（HRP）,利用Pt Pd-GS和HRP的协同催化作用来增强电流信号。该方法与传统阵列分析（每个检测点上检测一种蛋白）,检测通量增加了一倍。根据这种检测模型,若在同一检测点上同时检测三种或四种目标物,那么传感器的检测通量可以增加三倍以上。本研究所构建的检测模型将是一个新高通量分析物测定的模型。2.高效蛋白转化策略用于对胱抑素C的电化学灵敏检测目前,抗体依然是蛋白质检测中最主要的识别元件。然而,抗体作为识别元件大大增加了核酸技术在蛋白质检测中的应用难度。本研究结合夹心免疫反应,邻位触及反应和酶剪切目标循环策略设计了一个蛋白质分子转换体系,将蛋白质的检测转换为DNA的测定,在进行DNA测定时,再引入了将杂交链式反应（HCR）,从而成功的将HCR应用到蛋白质检测当中。在该蛋白质转换体系中,一个目标物（如胱抑素C）的输入可以转换为多个单链DNA的输出,从而提高了蛋白质检测的灵敏度。同时,输出的单链DNA再作为引发DNA在电极表面引发HCR,使电极表面产生大量的双链DNA聚合物,最后通过双链DNA聚合物和电活性物质硫堇（Thi）之间的静电吸附的作用,将大量的Thi固载到电极表面,从而输出可测的电化学信号。通过电极表面的HCR放大技术,进一步的提高了蛋白质检测的灵敏度。通过以上设计,成功的将酶剪切目标物循环和HCR两种核酸技术应用在蛋白质检测当中。实验结果表明该方法切实可行,具有检测限低、选择性好等特点。3.Cu、Mn双掺杂的二氧化铈纳米球作为信号标签和信号放大器构建的信号增强型电化学生物传感器电化学生物传感器构建中电信号的来源主要是依赖于具有电化学活性染料小分子。对纳米材料自身作为信号标签的关注还比较少。本研究合成了Cu、Mn双掺杂的二氧化铈纳米球（CuMn-CeO₂）作为信号标签、载体和催化剂构建了电化学免疫传感器用于对降钙素原（PCT）的测定。通过Cu、Mn双掺杂的作用,改善了CeO₂本身的电化学性能,使传感器的电流信号直接来源于CuMn-CeO₂,不需要再引入额外的电活性物质作为标签。同时,由于CuMn-CeO₂对H2O2的氧化具有良好的催化作用,在测试底液中加入H2O2时,二抗生物耦合物中的CuMn-CeO₂会催化H2O2氧化的同时促进Ce3+/Ce4+之间的电子传输,从而增强了电流信号,提高了检测的灵敏度。此外,CuMn-CeO₂不需要再经过其他的化学修饰就可直接作为载体固载PCT第二抗体。在该研究中,CuMn-CeO₂这种纳米材料同时作为信号标签、载体和信号放大器,大大地简化了传感器的构建步骤。本研究成功地利用纳米材料作为电活性物质来构建电化学生物传感器,拓展了纳米材料的应用范围。4.基于碱性磷酸酯酶和Hemin/G-四分体催化氧化1-萘酚构建的信号放大型凝血酶适体传感器的研究文献报道碱性磷酸酯酶是一类可以催化不具有电化学活性的底物水解生成具有电化学活性的物质的生物酶。由此,碱性磷酸酯酶广泛应用在构建电化学生物传感器当中。同时,这类传感器还结合了化学氧化还原循环放大策略来增强电化学信号去提高检测的灵敏度。这种信号放大策略是通过向测试底液中加入的强还原剂得以实现,但是,强还原剂的引入会致使碱性磷酸酯酶和生物分子的活性在一定程度上受到影响。本研究提出利用生物相容性好的Hemin/G-四分体作为催化剂,在H2O2存在的情况下,直接高效地催化氧化在电极表面原位产生的电活性物质1-萘酚来构建信号放大型电化学凝血酶适体传感器。在该传感器中,首先利用碱性磷酸酯酶催化水解1-萘酚磷酸酯,在电极表面原位产生了电活性物质1-萘酚,从而输出一个可测量的电化学信号。在加入H2O2后,Hemin/G-四分体会高效催化氧化1-萘酚,从而使输出的电流密度增加。为了进一步增强输出电流,将具有良好导电性的Au纳米修饰的ZnO纳米花作为载体用于增加生物分子的固载量,为电子传输提供良好的微环境。本研究探究了Hemin/G-四分体的新的催化活性,同时为基于碱性磷酸酯酶的电化学传感器提供了新的信号放大策略。5.基于DNA水凝胶和pH刺激信号放大构建的电化学阻抗传感器的研究电化学阻抗传感器一般是基于目标物自身阻碍电子传递所引起的阻抗变化来实现目标物的定量测定,其灵敏度较低。若目标物能够引发生成一些对电子传递具有更强的阻碍作用的物质生成,从而能够显著提高检测灵敏度。本研究通过目标物诱导形成对电子传递阻碍作用更强的水凝胶生成,再结合pH刺激增加水凝胶密度的方式来放大阻抗信号,构建了信号放大型阻抗传感器用于对乙酰肝素酶（HPA）的电化学检测。首先,在有目标物HPA存在时,HPA将引发DNA杂交从而在电极表面上形成水凝胶,同时将HPA包裹在水凝胶中。由于水凝胶和HPA都对电子传递具有阻碍作用,因此,可以得到一个与HPA浓度相关的阻抗信号。此外,在形成的水凝胶中,还设计有对H+有响应作用的DNA。当改变水凝胶的pH至5.0时,H+将会诱导所对应的DNA发生折叠促使水凝胶的密度增加,使水凝胶阻碍电子传输的作用进一步增强,从而可得到一个增强的阻抗信号。通过以上过程,显著地提高了传感器检测的灵敏度。本研究为构建信号增强型电化学阻抗传感器提供了新思路。