论文部分内容阅读
D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体,是一种天然的稀有单糖,在自然界中的存在量极少。D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70%。但能量值却极低,因此是一种理想的甜味剂和蔗糖替代品。此外,D-阿洛酮糖还有独特的生理功能和潜在的保健功能,受到了广泛的关注,包括减少脂肪堆积、降低餐后血糖水平、抑制肝脂肪酶活性、清除活性氧簇、治疗动脉粥样硬化疾病、增强胰岛素抗性和保护神经等。然而,D-阿洛酮糖在自然界存在极少,且化学合成困难,因此D-阿洛酮糖的生物合成受到了研究人员的重点关注。在D-阿洛酮糖的生物转化生产中,D-阿洛酮糖3-差向异构酶起着至关重要的作用。本论文分别构建了Dorea sp.DPEase、F.bacterium DPEase、Rhizobium sp.DPEase和Roseburia sp.DPEase的E.coli BL21（DE3）基因工程菌。对这四种蛋白酶进行分离纯化、产物鉴定以及酶学性质研究。得到Dorea sp.DPEase最适p H为酸性,且比酶活较高,因此对其进一步研究。将酸性Dorea sp.DPEase与实验室已鉴定的A.cellulolyticus GIase共同表达,实现从D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的一步法转化。将Dorea sp.DPEase编码基因整合到无抗性基因质粒pUB-P43-dore-dal上,并导入D-丙氨酸缺陷型B.subtilis1A751（dal-）中,实现Dorea sp.DPEase的食品级表达。同时,对Dorea sp.DPEase进行催化效率和热稳定性改造,并进行同源建模分析其构效关系。具体包括以下内容:（1）分别合成Dorea sp.DPEase、F.bacterium DPEase、Rhizobium sp.DPEase和Roseburia sp.DPEase的编码基因,连接至载体pET22b（+）,并转化到表达宿主E.coli BL21（DE3）。诱导目的蛋白表达,使用Ni2+层析柱分离纯化,并进行SDS-PAGE检测。四种重组蛋白的分子量在32-34 kDA范围内,与理论分子量相吻合。利用HPLC进行产物鉴定,四种酶均可以催化D-果糖生成D-阿洛酮糖,且最适底物为D-阿洛酮糖。（2）研究重组酶的酶学性质,Dorea sp.DPEase最适反应条件为pH 6.0和70°C;F.bacterium DPEase最适条件为pH 9.0和70°C;Rhizobium sp.DPEase最适条件为pH 9.0和65°C;Roseburia sp.DPEase最适条件为pH 7.0和65°C。其中,Dorea sp.DPEase的比酶活为803.5 U/mg,远高于其他DPEase（1.6-5.3倍）。四种酶均为离子依赖型酶,最适离子Co2+。Co2+还可以提高酶的结构稳定性:添加Co2+后Dorea sp.DPEase、F.bacterium DPEase、Rhizobium sp.DPEase和Roseburia sp.DPEase的Tm值分别提高了8.6、10.2、11.5和13.2℃。四种重组酶对D-阿洛酮糖、D-果糖和D-塔格糖均有催化活性,且相对活性依次降低;对L-山梨糖没有催化活性（F.bacterium DPEase除外）。以500 g/L的D-果糖为底物,在酸性高温条件下(70°C,p H 6.0,1 mmol/L Co2+),Dorea sp.DPEase、114 g/L D-阿洛酮糖,Dorea sp.DPEase的生物转化具有明显优势,反应速率和D-阿洛酮糖产量都要超过其他的DPEase。（3）将A.cellulolyticus GIase和Dorea sp.DPEase的编码基因分别连接至质粒pETDuet-1的Nde I和Xho I,Nco I和Hind III的酶切位点上,构建重组质粒pETDuet-Acce-GI/Dore-DPE。将共表达质粒导入E.coli BL21（DE3）,并进行发酵培养。、共表达细胞的最适反应条件为pH 6.5和75°C;60°C及以下时热稳定性较好;Co2+和Mn2+可以显著地提高细胞的催化活性;最适Co2+浓度为0.4 mmol/L。共表达细胞催化D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的平衡比例约为6.5:7:3;以500 g/L的D-葡萄糖为底物,可得到205 g/L的D-果糖和89.1 g/L的D-阿洛酮糖。（4）将Dorea sp.DPEase编码基因连接至无抗性基因质粒pUB-P43-DPE-dal上（D-丙氨酸消旋酶基因替换了质粒上的抗生素抗性基因）,成功构建双启动子重组质粒pUB-P43-dore-dal。将质粒导入D-丙氨酸缺陷型B.subtilis 1A751（dal-）,实现Dorea sp.DPEase的食品级表达。对重组枯草细胞进行发酵培养,27 h后发酵酶活可达到10.9U/mL。该重组枯草细胞的最适反应条件为pH 6.5和75°C,最适离子Co2+。使用40%乙醇渗透处理可以改善细胞的通透性,提高全细胞反应的催化效率（2.65倍）,发酵酶活可达到28.9 U/mL。（5）对Dorea sp.DPEase进行催化效率分子改造,选择位于底物O-4、O-5和O-6附近的氨基酸残基进行突变。得到正向突变体A38E和G105A,并构建了双点突变体A38E/G105A。A38E、G105A和A38E/G105A的相对酶活分别提高了22.3%、28.5%和38.6%;但热稳定与结构稳定性均有不同程度的下降。D-果糖为底物时,突变体的Km值降低,kcat/Km值增加,表明突变体与D-果糖的结合能力增强且对D-果糖的催化效率有所提高。使用Auto Dock软件将活性中心分别与D-果糖进行对接,A38E和G105A的氨基酸侧链会与H2O分子形成新的H键,可以进一步延伸固有的H键网络,使得突变体酶与D-果糖的亲和力增强。（6）对Dorea sp.DPEase进行热稳定性分子改造,选择位于亚基界面交互处的氨基酸进行突变,得到正向突变体V22C、F154Y、E191D、I193F和I193L,并构建多点突变体F154Y/E191D/I193F。I193F和F154Y/E191D/I193F最适温度升高了5°C;所有突变体的热稳定性和结构稳定性得到大幅度改善,包括50和60°C时的t1/2值以及Tm值均有明显提高。以500 g/L D-果糖为底物,F154Y/E191D/I193F突变体可得到148.2 g/L的D-阿洛酮糖,比野生型酶要多34.2 g/L;平衡转化率由22.8%上升至29.64%。同源建模发现,V22C可以与邻近α-螺旋上的Cys54形成较弱的二硫键,一定程度上增加两个α-螺旋间的相互作用,提高蛋白酶的稳定性;F154Y突变体与邻亚基的Asn152形成亚基间H键,E191D突变体可以与邻亚基的Asn213形成亚基间H键,增强两个亚基间的相互作用,提高多聚体蛋白酶的结构稳定性;I193F和I193L突变体可以增强表面疏水腔体的刚性,提高蛋白酶的结构稳定性。