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Xa21是一种抗水稻白叶枯病的基因,编码一个类受体蛋白激酶,在分子生物学和遗传育种方面具有重要的研究价值,它的蛋白产物XA21的亚细胞定位是整个研究体系的重要内容。 XA21蛋白质从C-端到N-端,主要由丝/苏氨酸激酶区（STK）、跨膜区（TM）、富亮氨酸重复区（LRR）和N-末端信号肽区（PSS）等结构域构成,推断认为,跨膜区或者连同信号肽一起可能对XA21蛋白质的亚细胞定位起决定作用。本研究采用融合绿色荧光蛋白标签法,确定XA21蛋白质的亚细胞定位并鉴定对定位起决定作用的结构域。 本试验根据Xa21的序列克隆了5个目的基因片段,从大到小依次命名为,Xa21FL（完整的Xa21 cDNA克隆）、Xa21 2115、Xa21 1971、Xa21 1911、Xa21 381,物理大小分别是3126bp、2115bp、1971bp、1911bp、381bp。它们的5′-末端都是从Xa21 cDNA*的起始密码子ATG开始、3′-末端逐次缺失那些被认为是重要结构域的基因编码区。所有克隆都包含有48bp的c-Myc及衔接头序列,Xa21 FL就是在原Xa21 cDNA的序列中加入了c-Myc序列,因而标记为Xa21 cDNA,二者实际上完全相同。Xa21 FL采用重组PCR方法去除中间一段内元拼接两段外元而获得。就上述克隆片段对应的表达产物而言,除XA21全蛋白外,其余4个蛋白质自C-末端起逐次缺失丝氨酸/苏氨酸激酶区（STK）、跨膜区（TM）、富亮氨酸重复区（LRR）小部分、富亮氨酸重复区绝大部分。将克隆的5个目的基因片段融合在GFPS65T（Ser65用Thr替代）编码序列的5′-端,构建融合GFPS65T蛋白基因的表达载体,连同对照的GFPS65T蛋白基因载体pGFPS65T,通过基因枪转化洋葱表皮细胞,培养24小时～48小时,用激光共聚焦显微镜检测法采集荧光图像,进行定位分析。由此,本试验得到以下结果: 1.采用重组PCR方法克隆了Xa21 FL（Xa21 cDNA）; 2.构建了5个融合目标基因片段的GFPS65T蛋白基因表达载体,pXa21 381-GFPS65T,pXa21 1911-GFPS65T,pXa21 1971-GFPS65T,pXa21 2115-GFPS65T,pXa21 FL-GFPS65T; 3.荧光图像定位分析表明,对照的荧光在整个细胞中都有分布,证明GFPS65T没有细胞分布的特定倾向,不会对融合蛋白的定位产生影响;XA21融合全蛋白荧光集中在质膜上,从而亚细胞定位XA21蛋白质在质膜上; 4.用反差法检验相应结构域缺失后的融合荧光蛋白定位与XA21融合荧光全蛋白的差异,借助差异分析鉴定对全蛋白定位起决定作用的结构域,发现缺失不同结构域的融合蛋白均在质膜、细胞核或者其它部位表达荧光。通过与全蛋白定位结果比较,表明XA21蛋白的正确亚细胞定位必须保持完整的全蛋白状态,而不是由预测的跨膜区或者信号肽的独立结构域所决定的。