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目的：
脑梗死早期治疗的关键是减轻缺血半暗带神经元的凋亡,已有实验证实VEGF可以促进脑缺血区血管的新生和侧支循环的建立,并有减轻脑缺血区神经元凋亡的作用,但其抗凋亡作用的机制还有待进一步研究。本实验研究VEGF165质粒转染SHSY5Y细胞,对氧糖剥夺诱导SHSY5Y细胞凋亡具有保护作用;FOX03a和GSK-3β蛋白的表达增多提示P13K/Akt信号传导途径是减少细胞的凋亡的途径之一。
实验方法：
用含10%胎牛血清和HEPES液(终浓度10mmol/L)改良的高糖DMEM培养基培养SH-SY5Y细胞,每2-3天换液,取传代后3天的SH-SY5Y细胞。试验分三步:
一、SH-SY5Y细胞培养分5组,选取4个氧糖剥夺时间点:SHSY5Y细胞正常培养组,SHSY5Y细胞氧糖剥夺4h恢复氧和血清供给后6h、12h、24h、48h组。检测各时间点的凋亡率的变化,以选取试验所需的最佳时间点。
二、用阳性脂质体转染法将VEGF165质粒转染入SHSYSY细胞分3组:取转染24h、转染48h以及转染72h三组,观察各时间点转染率的变化,以选取试验所需的最佳时间点。
三、氧糖剥夺实验分为5组
A组(正常对照组);
B组(OGD组):细胞氧糖剥夺4小时,恢复氧和血清供给24小时(步骤一结论);
C组(转染VEGF165质粒细胞组):细胞氧糖剥夺(同B组条件);
D组(转染VEGFl65质粒+SU5416干预组):细胞在氧糖剥夺(同B组条件)前30分钟同时加入SU5416(浓度为10umol/L);
E组(SU5416干预组):细胞在氧糖剥夺(同B组条件)前30分钟加入SU5416(浓度为10umol/L)。
采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞分析仪检测细胞凋亡率,用Western-Blotting法检测FOXO3a和GSK-3β的蛋白表达水平,观察转染VEGF165质粒对氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞的保护作用及对Pi3K/Akt信号传导途径中FOXO3a以及GSK-3β蛋白表达的影响。
实验结果：
1.各组SHSY5Y细胞氧糖剥夺后的凋亡率
氧糖剥夺各组的凋亡率较正常对照组的凋亡率显著增高,差别有统计学意义(P＜0.05);其中,氧糖剥夺4h恢复氧和血清供给后24h时间点的凋亡率较6h、12h、48h各时间点的凋亡率显著增高,差别有统计学意义(P＜0.05);将24时选取为试验所需的最佳时间点。
2.用阳性脂质体转染法转染后各时间点转染率的变化
用阳性脂质体转染法将VEGF165质粒转染入SHSY5Y细胞后,荧光显微镜下观察(EGFP)增强型绿色荧光蛋白的表达,验证VEGF165质粒转染成功;在高倍镜下选取4个不同视野,计算阳性细胞数,除以背景中总的细胞数,得出结论:转染24小时组转染效率较高。
3.转染VEGF165质粒后SH-SY5Y细胞凋亡结果
氧糖剥夺后,B、C、D、E组细胞凋亡率均较A组(正常对照组)显著增高,差别有统计学意义(P＜0.05);C组(转染VEGF165质粒细胞组)细胞凋亡率较B组(OGD组)显著减少,差别有统计学意义(P＜0.05);D组(转染VEGF165质粒+SU5416干预组)细胞凋亡率较C组(转染VEGF165质粒细胞组)显著增高,差别有统计学意义(P＜0.05);E组(SU5416干预组)细胞凋亡率较B组(OGD组)显著增高,差别有统计学意义(P＜0.05)。
4.蛋白免疫印迹结果
实验各组均见p-FOXO3a的蛋白表达,B、C、D、E组p-FOXo3a蛋白表达水平高于A组(正常对照组),差别有统计学意义(P＜0.05);C组(转染VEGF165质粒细胞组)p-FOXO3a蛋白表达水平高于B组(OGD组),(P＜0.05);D组(转染VEGF165质粒+SU5416干预组)p-FOXO3a蛋白表达水平低于C组(转染VEGF165质粒细胞组),(P＜0.05);E组(SU5416干预组)p-FOXO3a蛋白表达水平低于B组(OGD组),(P＜0.05)。
实验各组均见p-GSK-3β的表达,B、C、D、E组p-GSK-3β的蛋白表达水平明显高于A组(正常对照组),差别有统计学意义(P＜0.05);C组(转染VEGF165质粒细胞组)p-GSK-3β的蛋白表达水平明显高于B组(OGD组),差别有统计学意义(P＜0.05);D组(转染VEGF165质粒+SU5416干预组)p-GSK-3β的蛋白表达水平明显低于C组(转染VEGF165质粒细胞组),差别有统计学意义(P＜0.05);E组(SU5416干预组)p-GSK-3β的蛋白表达水平明显低于B组(OGD组),差别有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
转染VEGF165质粒的SHSY5Y细胞可减少氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞的凋亡,增加p-FOXO3a以及p-GSK-3β的表达,而SU5416(VEGFR2的特异性抑制剂)通过阻断VEGF的作用,抑制了VEGF165质粒对氧糖剥夺后SHSY5Y细胞的神经保护作用,提示转染VEGF165质粒的SHSY5Y细胞可使磷酸化的FOXO3a以及GSK-3β表达增加,从而减少氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞凋亡,对氧糖剥夺后神经细胞起到保护作用。