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盐生杜氏藻(Dunaliella salina,以下简称盐藻)是公认的能够耐受高盐的低等真核生物,是研究植物高盐适应的模式生物。多年以来,许多学者从盐藻适应高盐环境的渗透调节、耐盐相关基因的克隆及质膜、胞浆蛋白质等方面进行了研究,取得了一定的进展。但到目前为止,对其耐盐的分子机制和信号转导途径仍不清楚。细胞应对各种外界刺激的主要调节机制是对通路蛋白的磷酸化。蛋白激酶通过对底物蛋白的磷酸化参与细胞信号转导,是细胞信号转导过程中起重要作用的信号分子。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase,STPK)是其中最重要的一类蛋白激酶,可催化多种功能蛋白(如酶、受体、运输蛋白、调节蛋白、核内蛋白等)的磷酸化,从而调节细胞多种生命活动过程。因此,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的研究对于阐明盐藻复杂的耐盐机制具有重要的科学意义。 本研究构建了原核表达载体pGS-21a-DsSTPK,真核表达载体pMDCSGN和pBI121-DsSTPK,对已经获得的盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因进行了原核表达和亚细胞定位的分析,为进一步研究STPK在盐藻耐盐过程中的作用及分子机制提供了新的信息。主要的实验方法和结果如下: 1.应用PCR技术扩增了盐藻DsSTPK基因,并将其克隆到pMDTM18-T Simple Vector上。DNA测序结果表明,该核苷酸序列未发生突变。利用限制性内切酶分别酶切克隆载体与表达载体,T4 DNA连接酶连接目的片段与载体大片段,成功构建了原核表达载体pGS-21a-DsSTPK,真核表达载体pMDCSGN和pBI121-DsSTPK,经测序验证读码框正确。 2.将原核表达载体 pGS-21a-DsSTPK导入E.coli.BL21(DE3)中,经IPTG诱导在E.coli BL21中得到成功表达。通过SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均有存在。将上清蛋白经过GST标签蛋白纯化柱纯化后获得了纯度较高的可溶性融合蛋白, Western blot显示该融合蛋白能被抗GST单克隆抗体特异性识别,证明得到了纯化的 P-GST-DsSTPK蛋白。 3.将真核表达载体pMDCSGN导入农杆菌LBA4404感受态细胞中,用氨苄霉素进行转化子筛选。采用农杆菌介导法转染洋葱表皮细胞,荧光显微镜下观察DsSTPK的表达情况。结果表明,融合蛋白GFP-DsSTPK在洋葱表皮细胞膜及细胞质均有表达。证明盐藻DsSTPK分布在细胞膜及细胞质。