细胞壁多糖水解酶的发现和应用

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生物炼制在经济和环境的可持续发展等方面具有潜在的优势。然而其工业化生产的关键是原料的选择和预处理等问题。如可再生生物能源解决石油短缺问题时,细胞壁多糖水解酶在非粮燃料乙醇(第1.5代和2代燃料乙醇)的预处理过程中发挥了重要作用。本研究为了解决农作物废弃物的再利用和生物炼制问题,主要探讨了细胞壁多糖水解酶的作用机制,筛选到高效产细胞壁多糖水解酶的菌株,评估其应用潜能。另外该论文首次利用比较宏基因组和比较宏转录组技术对浓香型酒曲进行全面和深入的分析,探讨其中多种碳水化合物多糖降解酶系,同时进一步研究了微生物菌群的多样性,不仅有利于开发多种生物炼制可利用酶系,并且对改善白酒风味,提高酒精产量具有重要意义。  鲜芭蕉芋块茎因其高淀粉含量以及低营养需求,是生产燃料乙醇理想的非粮原料作物。但是鲜芭蕉芋高浓度发酵生产燃料乙醇的瓶颈之一是醪液粘度高,容易堵塞管路,严重影响工业化生产和增加能源消耗,同时也会降低乙醇发酵效率。为解决此问题,该研究在鲜芭蕉芋发酵醪中添加细胞壁多糖水解酶(酸性木聚糖酶及β-葡聚糖酶),50℃作用120 min,粘度由1677.30 Pa·s降到8.66 Pa·s;同时研究了细胞壁多糖水解酶对鲜芭蕉芋块茎燃料乙醇发酵作用,结果表明发酵前添加细胞壁多糖水解酶导致了总糖和可发酵性糖浓度增加,同时发酵醪粘度由200.00 Pa·s下降到2.98 Pa·s,乙醇发酵效率提高到94.5%;该研究进一步对鲜芭蕉芋燃料乙醇发酵培养基进行优化,只需添加750 mg/kg的尿素到发酵醪中,发酵效率即可达到96.11%;这项研究在5L发酵罐中进行验证,发酵效率高达98.3%。  为了探究细胞壁多糖水解酶对鲜芭蕉芋块茎发酵醪粘度影响的机制,本研究分别从物理和化学方面进行了分析。HPLC分析糖结果显示芭蕉芋发酵醪经过降粘预处理后,葡萄糖和总糖分别增加了28.07%和7.60%。同时利用扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)和激光共聚焦显微镜(CLSM)对芭蕉芋经过细胞壁多糖水解酶预处理后和对照发酵醪及淀粉颗粒进行分析,结果表明芭蕉芋发酵醪粘度的降低可能是因为细胞壁多糖结构的变化及淀粉颗粒的变化。因此,经过降粘预处理后,非淀粉类多糖与淀粉共被酵母所利用,提高了乙醇的发酵效率。  为了进一步探究降粘机制,本研究还分析了块茎类作物经细胞壁多糖水解酶处理时多糖的变化。多糖单克隆抗体芯片(糖芯片)是一种利用高灵敏度的单克隆抗体(mAbs)和碳水化合物结合分子(CBMs)分析细胞壁多糖的高通量芯片技术。本研究首次利用该技术研究块茎类作物粘度降低整个过程中(打浆、液化、110℃,20 min、添加细胞壁多糖水解酶)多糖的变化。本研究中块茎类原料主要包括甘薯(商薯19、南薯007)、木薯和芭蕉芋,细胞壁多糖水解酶主要包括木聚糖酶、纤维素酶、GC220和葡聚糖酶。糖芯片结果表明不同的块茎之间细胞壁多糖组成成分差异较大;胶状的阿魏酸酯化的阿拉伯聚糖和纤维素交联的蛋白网络结构导致芭蕉芋块茎发酵醪粘度降低困难;甘薯和木薯粘度降低主要是因为同型半乳糖醛酸的降解和(1-4)-beta-D-半乳聚糖和(1-5)-alpha-L-阿拉伯聚糖的释放。  为了解决商品酶成本高的问题,本研究从腐烂甘薯中筛选到的赭绿青霉(Penicillium ochrochloron Biourge)能产细胞壁多糖水解酶,并对甘薯燃料乙醇发酵醪具有高效的降粘作用。分离到的菌株经过液态发酵,生产的细胞壁多糖水解酶粗酶液包括13种降解纤维素、半纤维素、果胶、淀粉和蛋白酶系。经过产酶培养基的优化,该菌以20g/L玉米芯为唯一碳源、4.5 g/L硝酸铵为唯一氮源、起始培养基pH为6.5、发酵5天后的粗酶液具有最高甘薯发酵醪的降粘能力。甘薯发酵醪经粗酶液预处理后的经过燃料乙醇发酵,其发酵效率(92.58%)高于商品纤维素酶(88.06%)和未经酶预处理的空白对照(83.50%)。当该酶液生产规模扩大到0.5 L、5L和100 L时,其粘度下降率分别为85%、90%和91%。因此,赭绿青霉产生的细胞壁多糖水解酶能降低甘薯发酵醪粘度并进一步用于燃料乙醇的生产。  为了发现更多高效和新的嗜热细胞壁多糖水解酶系,本研究以浓香型酒曲制曲过程中的四种样品为研究对象,在比较宏基因组和比较宏转录组水平上探讨了酒曲微生物菌群多样性和碳水化合物降解酶系。酒曲微生物体系具有多样性和稳定性,对白酒生产具有重要的作用。本研究以浓香型酒曲制曲过程中的四种样品为研究对象,以Roche454 FLX+高通量第二代测序技术,通过测定酒曲微生物基因组核糖体RNA高变区域16S rDNA和ITS序列,研究酒曲在不同过程中细菌和真菌群落的多样性及微生物群落之间的关系。细菌共检测到51545条有效序列,聚类生成3757个OTU;真菌共检测到58912条有效序列,聚类生成1034个OTU。通过对细菌和真菌的群落组成分析和基于OTU的维恩图和热图分析,结果表明四种酒曲样品中,细菌共有113个OTU(4.03%);真菌只有3个OTU相同(0.35%),并且四个样品间丰度最高的有8种细菌和6种真菌。本研究进一步利用Illumina Hi-Seq2000高通量第二代测序技术,通过对基因组分的分析,基于CAZy对细胞壁多糖水解酶基因进行功能注释和分析,结果表明,浓香型酒曲N2、N3样品中分别共有729和932种细胞壁多糖水解酶系(包括糖苷水解酶,糖基转移酶,多糖裂合酶,碳水化合物酯酶)及48和64种碳水化合物结合分子,其中糖苷键水解酶家族均高效表达。并且该酒曲能分泌丰富的纤维素酶、内切半纤维素酶、细胞壁伸展酶系、细胞壁分支酶以及寡糖降解酶系。这充分体现了酒曲较强的糖化能力,同时为新酶系的开发提供了分子基础。  农业废弃物中含有的多聚物如植物细胞壁多糖因结构的复杂性而导致了生物抗性问题。本研究通过研究细胞壁多糖水解酶的基本特性,筛选降解细胞壁多糖的菌株,评估其应用潜能,并在分子和生物信息学及基础上发现环境中新的酶系,以期应用这些经济高效多聚物降解酶系于生物炼制过程中,实现经济和环境的可持续发展。
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