目的： 构建含有小鼠反义血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)基因并受四环素反应性元件调控的真核表达质粒(pTRE2-antisenseTSP-1，pTRE2-AsTSP-1)，为构建诱导抑制TSP-1表达的转基因糖尿病小鼠动物模型提供工具。同时检测增生型糖尿病视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy，PDR)玻璃体中TSP-1和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表达水平，以探讨TSP-1和VEGF在PDR中的作用。 方法： 一、受四环素调控的反义血小板反应蛋白-1基因重组质粒的构建 1、从正常C57BL/6小鼠的视网膜中提取总RNA，上游引物含有ClaI内切酶位点，下游引物含有BamHI内切酶位点，行RT-PCR扩增TSP-1基因C端1.2Kb片段。 2、对pTRE2hyg质粒和TSP-1基因的PCR产物进行双酶切(内切酶为：BamHI和ClaI)，行琼脂糖电泳分离，胶回收酶切后的载体和目的基因片段。 3、将回收的pTRE2hyg质粒和TSP-1基因链接，反义TSP-1基因在质粒多克隆基因位点的BamHI和ClaI内切酶位点插入到pTRE2hyg中，获得重组体pTRE2-AsTSP-1。 4、将重组体转化大肠杆菌DH5a，大量扩增重组体。 5、利用双酶切和测序对重组体进行鉴定，正确链接的重组体大量扩增备用。 二、增生型糖尿病视网膜病变患者玻璃体中血小板反应蛋白-1和血管内皮生长因子的检测 1、实验材料：收集实验组PDR患者23例(23眼)和对照组特发性黄斑裂孔患者6例(6眼)行玻璃体切除手术时切取的玻璃体标本，同时记录患者的性别、年龄、有无玻璃体积血、玻璃体切除术前是否行视网膜激光网膜光凝术。 2、TSP-1和VEGF表达的检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)，检测实验组PDR和对照组特发性黄斑裂孔患者玻璃体TSP-1和VEGF的质量浓度。 3、TSP-1和VEGF表达的分析：利用两样本间的t检验对实验组和对照组玻璃体TSP-1的含量进行统计学分析，利用等级秩和检验(MannWhitney法)对实验组和对照组玻璃体VEGF的含量进行统计学分析，采用Spearman相关检验进行玻璃体中TSP-1和VEGF的相关性分析。 结果： 一、受四环素调控的反义血小板反应蛋白-1基因重组质粒的构建 1、已构建的pTRE2-AsTSP-1重组质粒经BamHI和ClaI内切酶双酶切鉴定含有长度为5.3Kb的质粒片段和1.2Kb的TSP-1基因片段。 2、已构建的pTRE2-AsTSP-1重组质粒测序鉴定含有完整的反义TSP-1基因片段。 二、增生型糖尿病视网膜病变患者玻璃体中血小板反应蛋白-1和血管内皮生长因子的检测 1、PDR患者玻璃体TSP-1的质量浓度为：977.73±116.03ng/mL；对照组为：861.57±84.57ng/mL。两者差别有统计学意义(P＜0.05)。 2、PDR患者玻璃体VEGF的质量浓度为：1564.02±1023.51pg/mL；对照组为：246.38±186.49pg/mL，两者差别有统计学意义(P＜0.05)。 3、PDR患者玻璃体TSP-1与VEGF有正相关性，r=0.445，(P＜0.05)。 结论： 1、成功构建了pTRE2-AsTSP-1重组质粒。可用于pTet-on系统为下一步构建可调控的专一抑制TSP-1表达的转基因糖尿病小鼠奠定了实验基础。 2、PDR患者玻璃体TSP-1和VEGF表达量的增加表明其在PDR发展过程中起重要的作用，推测增加玻璃体TSP-1的含量同时予以抗VEGF治疗有望成为控制PDR发展的有效途径之一。