论文部分内容阅读
长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度大于200 nt，以RNA形式发挥作用的转录产物。根据lncRNA与蛋白编码基因的相对位置，可分为:正义(sense)、反义(antisense)、双向(bidirectional)、内含子(intronic)、基因间(intergenic)五类。H Y.Chang等人近期总结了基因组范围内筛选lncRNAs的一般策略，即通过将基因组片段上组蛋白修饰活性数据与RNA-seq数据相结合分析，寻找潜在的基因间lncRNAs;进而对lncRNAs的编码能力进行分析，确定它们的非编码性质。上述方法对寻找基因间lncRNAs比较有效，但对于编码基因内部与基因同向的正义lncRNAs和内含子lncRNAs的筛选却存在一定的局限性。
选择性剪接(Alternative Splicing)是产生蛋白质功能多样性的重要途径之一。以往研究更多关注编码基因剪接多样性，也有相关研究报道lncRNAs也存在选择性剪接。RNA结合蛋白PCBP2在小鼠和人中均存在由选择性剪接产生的多种转录本形式，且在不同的生物学过程中发挥作用。研究报道该基因9号外显子位置有可转录lncRNA的存在，即T-UC.338，其在肝癌中发挥重要的生物学功能，但该区域是否仅存在T-UC.338一个非编码RNA转录物尚不可知。
本研究即以PCBP2内部的9号外显子区域为研究对象，探讨在该区域发现潜在lncRNAs的生物信息学分析方法，以及该区域内lncRNAs发生多重转录、剪接的可能。本研究从现有的数据库(UCSC http://genome.ucsc.edu/)入手，选择在同一基因座位(PCBP2的9号外显子区，UC.338基因座位)上，由内含子区域转录、剪接形成的ESTs进行鉴定和分析，并根据同源性分析结果在人和小鼠中分别进行筛选，得到四个ESTs:人源ESTs HY121526和DB276896，鼠源ESTs BQ917950和BF150035。利用Coding Potential Calculater(CPC http://cpc.cbi.pku.edu.cn)进行蛋白质编码能力分析，并将CPC分析得分与同基因座位上的对应编码基因(PCBP2)的CPC分值进行统计学比较，筛选潜在的lncRNAs。其中HY121526、BQ917950和BF150035均显示非编码RNA的性质。同时本研究用PCR方法检测这四个ESTs以及T-UC.338在不同组织中的表达谱和在同一组织中不同时间点的表达变化来排除其为转录噪音的可能性，最终发现在人各细胞系中HY121526的表达具有一定的细胞特异性，没有检测到DB276896的表达，人源T-UC.338(H-T-UC.338)的表达也具有一定的细胞特异性;在小鼠各组织中BQ917950的表达不仅具有组织特异性，并且BQ917950在小鼠大脑发育不同时间点的表达随时间的推移呈明显下降趋势，而BF150035在小鼠各组织中广泛表达。鼠源T-UC.338(M-T-UC.338)的表达也具有组织特异性，在小鼠大脑发育不同时间点的表达随时间的推移呈现先上升后下降的趋势。
本研究用RACE和步移的方法验证了H-T-UC.338的全长序列，发现H-T-UC.338的长度要超出文献报道的590bp，并检测了鼠源M-T-UC.338的全长。本研究分别做了探针，下一步将尝试用Northern的方法验证各lncRNAs的全长。根据相关报道，lncRNA很可能通过其所在基因座位上的编码基因起作用，并具有一定的保守性，虽然H-T-UC.338在肝癌中与PCBP2并无调控关系，但是在其他生物学事件中可能会有相关性。本研究用Real-timePCR和原位杂交实验检测了BQ917950、BF150035、M-T-UC.338和PCBP2在小鼠发育不同时间点大脑中的表达情况，以推测基因与潜在lncRNA之间的关系，为推测在小鼠大脑发育过程中各lncRNAs的功能给予提示。