本研究旨在探讨PEDF诱导肿瘤细胞凋亡的功能表位，明确PEDF34是否具有促进内皮细胞凋亡类似的促进前列腺癌细胞凋亡的效应和是否通过相同的死亡受体信号通路。本研究是从以下三方面展开：(1)运用基因工程方法获得PEDF、PEDF34纯化蛋白，在裸鼠前列腺癌异位种植瘤模型上观察PEDF34抑制前列腺癌生长的效应并探讨其作用机制；(2)分析PEDF34抗血管增生活性，并探讨其作用的信号通路；(3)明确PEDF34是否能够直接促进肿瘤细胞凋亡，并系统探讨其作用的信号通路；探讨PEDF34促细胞凋亡作用的受体。　　 主要研究内容和结果如下：　　 第1部分PEDF34重组质粒的构建及PEDF34蛋白表达纯化　　 1.成功构建pGEX-4T-1/PEDF34重组质粒。测序结果表明目的基因片段与pGEX-4T-1连接无误，阅读框架正确，pGEX-4T-1/PEDF34重组质粒构建成功。　　 2.获得高纯度可溶性的PEDF34融合蛋白。鉴定正确的重组体转化到BL21(DE3)宿主菌中，经IPTG低温诱导，表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经超声后，离心取上清，通过GST亲和柱Glutathione Sepharose4B纯化，获得高纯度可溶性融合蛋白。纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后PEDF34-GST融合蛋白纯度可达95％。纯化的重组蛋白经Western-blot分析显示有明显的免疫杂交带。　　 3.凝血酶切割PEDF34-GST融合蛋白后的再次分离纯化。用凝血酶对融合蛋白进行切割，切割产物采用超滤(Ultrafiltration)方法可分离纯化获得PEDF34功能片段多肽。　　 4.PEDF34 N-端氨基酸序列测定及二级结构鉴定。Edman降解法精确测定PEDF34多肽N-端氨基酸序列，与理论设计相符。采用圆二色谱法(Circulardichroism)测定纯化PEDF34功能片段多肽的二级结构，显示PEDF34蛋白二级结构以α-螺旋为主，与软件推测结果相符。　　 第2部分PEDF34通过抗血管新生抑制前列腺癌生长的作用及分子机制研究　　 1.PEDF34抑制裸鼠前列腺癌生长。腹腔注射PEDF34总剂量为25 mg/kg时，对BALB/c裸鼠前列腺癌(PC-3)实体瘤生长具有显著的抑制作用(P＜0.05)，抑瘤率为69.4％；　　 2.PEDF34抑制前列腺癌血管新生。采用血管内皮细胞特异的CD31抗体，用SP免疫组织化学法鉴定裸鼠前列腺癌组织的微血管密度(MVD)。结果表明：PEDF34处理组肿瘤组织血管密度较PBS组减少(P＜0.05)，提示PEDF34通过抗血管新生抑制前列腺癌生长。　　 3.PEDF34诱导内皮细胞凋亡。PEDF34剂量依赖性地抑制HUVECs的存活，IC50为320nmol/L。流式细胞仪检测细胞凋亡，PEDF34处理组HUVECs的细胞凋亡率显著地高于PBS对照组(P＜0.05)，表明PEDF34具有诱导内皮细胞凋亡的作用。PEDF34对正常肝细胞(chang liver)的存活无明显的影响，显示了PEDF34具有抑制内皮细胞的特异性。　　 4.PEDF34激活内皮细胞死亡受体信号通路。　　 4.1 PEDF34通过激活Fas-FasL死亡受体通路诱导HUVECs凋亡。Westernblotting分析结果显示，PEDF34上调HUVECs细胞Fas-L的表达及Caspase-8的切割，而Fas表达无明显变化。同时检测了肿瘤组织中Fas-L的表达及Caspase8的切割情况，结果显示PEDF34处理组的肿瘤组织中Fas-L的表达高于对照组，肿瘤组织中的Caspase8的切割高于对照组，Fas无明显差别。　　 4.2 PEDF34通过激活转录因子PPAR-γ上调Fas-L的表达。Westernblotting分析结果显示，PEDF34上调内皮细胞PPAR-γ的表达。PPAR-γ抑制剂GW9662处理HUVECs后，PEDF34上调FasL的作用减弱，NF-κB抑制剂PDTC无此作用。证明PEDF34通过激活转录因子PPAR-γ促进Fas-L的表达。　　 4.3 JNK通路激活介导PEDF34对内皮细胞PPAR-γ的调节。采用Western-blot法检测PEDF34处理不同时间的HUVECs中MAPK(ERK、JNK、p38)的激活。结果显示，PEDF34在15min激活HUVECs中JNK。JNK抑制剂SP600125能抑制PEDF34引起的PPARγ的上调，表明PEDF34通过激活JNK来激活转录因子PPARγ。　　 第3部分PEDF34通过直接诱导前列腺癌细胞凋亡抑制肿瘤生长的作用及分子机制　　 1. PEDF34诱导肿瘤组织细胞凋亡。运用组织切片原位末端标记技术(TUNEL)原位检测肿瘤组织的细胞凋亡，结果显示PEDF34处理组肿瘤组织中凋亡细胞显著多于对照组，统计学分析差异有显著性(P＜0.05)。提示PEDF34可以直接诱导肿瘤组织细胞的凋亡。　　 2.PEDF34以剂量依赖性方式抑制前列腺癌细胞PC-3的存活，诱导PC-3细胞凋亡。PEDF34剂量依赖性抑制PC-3的存活，IC50为640nmol/L。利用流式细胞仪检测凋亡，PEDF34处理组PC-3细胞凋亡率显著高于PBS对照组(P＜0.05)，表明PEDF34具有直接诱导PC-3细胞凋亡的作用。PEDF34对正常肝细胞(chang liver)的存活无明显的影响，显示了PEDF34具有特异性抑制肿瘤细胞的作用。　　 4.PEDF34激活前列腺癌细胞死亡受体信号通路。　　 4.1 PEDF34通过激活Fas-Fas-L死亡受体通路诱导PC-3凋亡。Westernblotting分析结果显示，PEDF34促进PC-3细胞Fas-L的表达及细胞Caspase8的切割，而Fas表达无明显变化。同时检测了裸鼠前列腺癌肿瘤组织中Fas-L的表达及Caspase8的切割情况，结果显示PEDF34处理组肿瘤组织的Fas-L的表达明显高于对照组，肿瘤组织中的Caspase8的切割高于对照组，Fas无明显差别。运用RNA干扰的方法，下调PC-3细胞Fas-L的表达后，PEDF34促凋亡作用明显降低。证明PEDF34通过Fas-L-caspase-8受体凋亡通路诱导PC-3凋亡。　　 4.2 PEDF34通过激活转录因子PPAR-γ促进Fas-L的表达。Westernblotting分析结果显示，PEDF34促进PC-3细胞PPAR-γ的表达，而NF-κB无明显激活。PPAR-γ抑制剂GW9662处理PC-3细胞后，PEDF34上调PC-3细胞FasL作用减弱，NF-κB抑制剂PDTC无此作用。运用RNA干扰的方法，下调PPARγ与NF-κB的表达，PPARγ干扰组PEDF34上调FasL作用减弱，NF-κB干扰组PEDF34仍然上调FasL。FasL启动子荧光素酶报告基因分析显示，PEDF34上调细胞核内FasL启动活性，PPARγ抑制剂GW9662减弱此作用。证明PEDF34可能通过激活转录因子PPAR-γ促进Fas-L的表达。　　 4.3JNK通路的激活介导PEDF34对PC-3细胞PPAR-γ表达的调控和转录功能的发挥。采用Western-blot法检测PEDF处理不同时间点的PC-3细胞中MAPK(ERK、JNK、p38)的激活。结果显示，PEDF34激活PC-3细胞中JNK。JNK抑制剂SP600125能抑制PEDF34引起的PPARγ及Fas-L的上调，表明PEDF34通过激活JNK促进PPARγ的表达及转录功能的发挥。　　 5.LR受体介导PEDF34诱导PC-3细胞凋亡的作用。运用LR抗体拮抗后，PEDF34上调PC-3细胞FasL的作用减弱。运用RNA干扰下调LR表达后，能抑制PEDF34引起的PPARγ及Fas-L的上调，表明PEDF34通过作用于LR受体来介导PPARγ的上调，发挥促PC-3凋亡的作用。　　 结论及研究意义：　　 1.运用基因工程方法获得PEDF34纯化蛋白，lL细菌培养物可获得纯化融合蛋白60mg。　　 2.PEDF34通过诱导内皮细胞凋亡、抑制血管新生抑制前列腺癌生长。首次阐明PEDF34通过激活转录因子PPARγ上调Fas-L从而激活死亡受体通路诱导内皮细胞凋亡。该研究阐明了PEDF34诱导内皮细胞凋亡的机制。　　 3.首次证实PEDF34具有诱导PC-3细胞凋亡的作用。首次阐明了PEDF34通过激活Fas-Fas-L死亡受体通路诱导PC-3细胞凋亡；PEDF34对FasL启动激活依赖转录因子PPARγ，而不是NF-κB；JNK MAPK的激活介导了PEDF34对转录因子PPARγ的调控，层粘连蛋白受体(LR)介导了PEDF34的促凋亡作用。首次系统阐明PEDF34具有通过LR-JNK-PPARγ-FasL-caspase-8通路直接诱导肿瘤细胞凋亡的活性。　　 4.PEDF34通过抑制血管新生和直接促进前列腺癌细胞凋亡的双重作用抑制前列腺癌生长。